Kommissionens genomförandeförordning (EU) 2024/771 av den 29 februari 2024 om ändring av förordning (EG) nr 152/2009 om provtagnings- och analysmetoder för offentlig kontroll av foder

”BILAGA I

PROVTAGNINGSMETODER

1.   SYFTE OCH TILLÄMPNINGSOMRÅDE

Prover som är avsedda för offentlig kontroll av foder ska tas med de metoder som beskrivs nedan. Prover som har tagits på detta sätt ska anses vara representativa för de provtagna mängderna.

Syftet med representativ provtagning är att ta ut en liten fraktion av ett parti på ett sådant sätt att bestämningen av en viss egenskap hos denna fraktion representerar medelvärdet av denna egenskap i partiet. Partiet ska provtas genom att det upprepade gånger tas delprover från olika enskilda platser i partiet. Dessa delprover ska blandas så att det bildas ett enda samlingsprov, från vilket representativa slutliga prover ska beredas genom representativ delning.

Om det vid en okulärbesiktning eller baserat på annan relevant information visar sig att delar av det foder som ska provtas skiljer sig i kvalitet från resten av fodret från samma parti, ska sådana delar skiljas från resten av fodret och behandlas som ett separat delparti. Om det inte är möjligt att dela upp fodret i separata delpartier ska fodret provtas som ett parti. I sådana fall ska detta nämnas i provtagningsrapporten.

Om det har konstaterats att ett foder som provtagits i enlighet med bestämmelserna i denna förordning inte uppfyller EU-kraven, och detta ingår i ett foderparti av samma kategori eller varuslag, ska man anta att inget foder i detta parti uppfyller kraven, utom om man efter en utförlig bedömning kan konstatera att det inte finns några belägg för att resten av partiet inte uppfyller EU-kraven.

Provtagningen får också inbegripa foder som saluförs av foderföretagare med hjälp av distanskommunikation i enlighet med artikel 11.3 i Europaparlamentets och rådets förordning (EG) nr 767/2009 (1). Provtagning av foder som saluförs med hjälp av distanskommunikation ska i regel omfattas av punkterna i denna bilaga. Särskilda aspekter gällande provtagning av distansförsäljningsprover beskrivs i punkt 11.

2.   DEFINITIONER

—

parti (eller sats): identifierad mängd foder som konstaterats ha gemensamma egenskaper som ursprung, sort, förpackningstyp, förpackare, avsändare eller märkning; när det gäller en produktionsprocess, en produktionsenhet från ett och samma tillverkningsställe som framställts med samma produktionsparametrar, eller ett antal sådana enheter som producerats samtidigt och lagrats tillsammans.

—	provtagen mängd: parti eller identifierad del av partiet eller delpartiet.

—	förseglat prov: prov som förseglats på sådant sätt att det blir omöjligt att få tillgång till provet utan att förseglingen bryts eller avlägsnas.

—	delprov: viss mängd som tagits från ett ställe i den provtagna mängden.

—	samlingsprov: blandning av delprover som tagits från samma provtagna mängd.

—	reducerat prov: del av samlingsprovet som erhållits ur detta genom representativ reduktion.

—	slutligt prov: del av samlingsprovet (blandat), av det reducerade provet eller av det homogeniserade samlingsprovet, beroende på typ av kontroll (se punkt 9.4).

—	laboratorieprov: prov som är avsett för laboratoriet (såsom det tagits emot av laboratoriet) och som kan vara det slutliga provet, det reducerade provet eller samlingsprovet.

—	distansförsäljningsprov: prov av parti eller sats av foder som saluförs med hjälp av distanskommunikation.

3.   ALLMÄNNA BESTÄMMELSER

—	Proverna ska tas av personer som den behöriga myndigheten har bemyndigat för detta.

—	För ett distansförsäljningsprov ska den behöriga myndigheten begära en mängd av fodret från foderföretagaren med hjälp av distanskommunikation.

—	Provet ska förseglas på sådant sätt att det blir omöjligt att få tillgång till provet utan att förseglingen bryts eller avlägsnas.

Förseglingens märke bör vara klart identifierbart och synligt.

—	Identifiering av provet: provet ska vara märkt på ett outplånligt sätt och ska identifieras på ett sådant sätt att det finns en otvetydig koppling till provtagningsrapporten.

—

Från varje samlingsprov eller reducerat prov ska följande slutliga prover tas: ett för kontroll (tillsyn) och ett för foderföretagaren (överklagande). Slutligen får ytterligare ett slutligt prov tas som referens. Om hela samlingsprovet homogeniseras, tas de slutliga proverna från det homogeniserade samlingsprovet, såvida detta inte strider mot medlemsstaternas bestämmelser om foderföretagares rättigheter.

—

Om det är nödvändigt för att utföra officiell provtagning och om behöriga myndigheter så kräver ska foderföretagarna i enlighet med artikel 15.1 och 15.2 i förordning (EU) 2017/625 — ge de behöriga myndigheternas personal tillgång till utrustning under deras kontroll, vid behov inbegripet tillgång till rätt provtagningsutrustning och personlig skyddsutrustning, — bistå och samarbeta med de behöriga myndigheternas personal för att möjliggöra provtagningen, bland annat genom att ge de behöriga myndigheternas personal tillgång till foder.

4.   UTRUSTNING

4.1   Provtagningsutrustningen ska vara tillverkad av material som inte kan kontaminera de produkter som ska provtas. Utrustning som är avsedd att användas flera gånger ska vara lätt att rengöra för att undvika korskontaminering.

4.2   Utrustning som rekommenderas för provtagning av fast foder

4.2.1   Manuell provtagning

4.2.1.1

Flatbottnad provtagningsskyffel med vertikala sidor.

4.2.1.2

Provtagningsspjut med en lång skåra eller med olika fack. Provtagningsspjutets dimensioner ska lämpa sig för den provtagna mängdens egenskaper (behållarens djup, säckformat osv.) och fodrets partikelstorlek. Om provtagningsspjutet har flera öppningar som ska garantera att provet tas på de olika ställena utmed spjutet, bör öppningarna separeras av fack eller sekventiellt förskjutna öppningar.

4.2.2   Mekanisk provtagning

Lämplig mekanisk utrustning får användas för provtagning på foder i rörelse. Den mekaniska utrustningen ska anses lämplig när prover tas på åtminstone hela sektionen av flödet.

Provtagning på foder i rörelse (vid höga flödeshastigheter) kan utföras med automatiska provtagare.

4.2.3   Provdelare

Om så är möjligt och lämpligt, bör utrustning avsedd att dela upp provet i ungefär lika stora delar användas för beredning av reducerade prover på ett representativt sätt.

5.   KVANTITATIVA KRAV FÖR ANTALET DELPROVER

—

De kvantitativa kraven i punkterna 5.1 och 5.2 för antalet delprover är tillämpliga på provtagna mängder på högst 500 ton som kan provtas på ett representativt sätt. Det beskrivna provtagningsförfarandet gäller även större kvantiteter än den föreskrivna största provtagna mängden, under förutsättning att det högsta antalet delprover som anges i tabellerna i punkterna 5.1.1, 5.1.3 och 5.1.5 lämnas utan avseende och antalet delprover bestäms utifrån den kvadratrotsformel som anges i den relevanta delen av förfarandet (se punkt 5.3) och minsta storleken på samlingsprovet ökas proportionellt. Detta förhindrar inte att ett större parti delas upp i mindre delpartier och att varje delparti provtas i enlighet med det förfarande som beskrivs i punkterna 5.1 och 5.2.

—	Den provtagna mängden ska vara av sådan storlek att var och en av dess beståndsdelar kan provtas.

—	För mycket stora partier eller delpartier (> 500 ton) och för partier som transporteras eller lagras på sådant sätt att provtagning inte kan ske enligt det provtagningsförfarande som anges i punkterna 5.1 och 5.2 ska det provtagningsförfarande som anges i punkt 5.3 användas.

—	När det gäller distansförsäljningsprover känner den behöriga myndigheten oftast inte till storleken på det parti från vilket mängden begärs. Således kan förfarandet i punkterna 5.1 och 5.2 inte användas. I det fallet ska förfarandet i punkt 11 användas.

—

Om en foderföretagare enligt lag är skyldig att följa denna förordning inom ramen för ett obligatoriskt övervakningssystem, får foderföretagaren avvika från de kvantitativa krav som föreskrivs i denna punkt för att ta hänsyn till operativa egenskaper, förutsatt att foderföretagaren på ett tillfredsställande sätt har visat för den behöriga myndigheten att provtagningsförfarandet är likvärdigt i fråga om representativitet och efter godkännande av den behöriga myndigheten.

—

Om det inte är möjligt att använda den angivna provtagningsmetoden vad gäller de kvantitativa kraven beroende på oacceptabla kommersiella skador på partiet (på grund av förpackningstyper, transportmedel, lagring osv.) kan i undantagsfall en alternativ provtagningsmetod användas, förutsatt att den ger så representativa resultat som möjligt och att den beskrivs och dokumenteras i sin helhet.

5.1   Kvantitativa krav för delprover vid kontroll av ämnen eller produkter som är jämnt fördelade i fodret

5.1.1   Fast foder i lös vikt

Storlek på provtagen mängd	Minsta antal delprover
≤ 2,5 ton	7
> 2,5 ton	√(20 gånger det antal ton som utgör provtagen mängd) (*1) , upp till 40 delprover

5.1.2   Löst flytande foder

Storlek på provtagen mängd	Minsta antal delprover
≤ 2,5 ton eller ≤ 2 500 liter	4  (*2)
> 2,5 ton eller > 2 500 liter	7  (*2)

5.1.3   Förpackat foder

Foder (fast och flytande) kan förpackas i påsar, säckar, burkar, tunnor osv. som i följande tabell anges som enheter. Stora enheter (≥ 500 kg eller liter) ska provtas i enlighet med bestämmelserna för löst foder (se punkterna 5.1.1 och 5.1.2).

Storlek på provtagen mängd	Minsta antal enheter från vilka (minst) ett delprov ska tas (*3)
1 –20 enheter	1 enhet (*4)
21 –150 enheter	3 enheter (*4)
151 –400 enheter	5 enheter (*4)
> 400 enheter	¼ av √(det antal enheter som utgör provtagen mängd) (*5), upp till 40 enheter

5.1.4   Foderblock och saltstenar

Prover ska tas på minst ett block eller en sten per provtagen mängd om 25 enheter, som mest fyra block eller stenar.

För block eller stenar på högst 1 kg/styck ska ett delprov utgöras av ett block eller en sten.

5.1.5   Grovfoder/vallfoder

Storlek på provtagen mängd	Minsta antal delprover (*6)
≤ 5 ton	5
> 5 ton	√(5 gånger det antal ton som utgör provtagen mängd) (*7), upp till 40 delprover

5.2   Kvantitativa krav för delprover vid kontroll av beståndsdelar eller ämnen som troligen är ojämnt fördelade i foder

Dessa kvantitativa krav för delprover ska användas i följande situationer:

—	Kontroll av aflatoxiner, mjöldryga, andra mykotoxiner och skadliga botaniska orenheter i foderråvaror.

—	Kontroll av korskontaminering med en beståndsdel, inbegripet genetiskt modifierade material, eller ett ämne för vilket en ojämn fördelning förväntas i foder.

Om tillsynsmyndigheten har en stark misstanke om att det finns en sådan ojämn fördelning även vid korskontaminering med en beståndsdel eller ett ämne i en foderblandning kan de kvantitativa kraven enligt följande tabell tillämpas.

Storlek på provtagen mängd	Minsta antal delprover
< 80 ton	Se de kvantitativa kraven i punkt 5.1. Antalet delprover som ska tas ska multipliceras med 2,5
≥ 80 ton	100

5.3   Kvantitativa krav för delprover vid mycket stora partier

När det gäller stora provtagna mängder (provtagna mängder > 500 ton) är antalet delprover som ska tas = 40 delprover + √ton vid kontroll av ämnen eller produkter som är jämnt fördelade i fodret eller 100 delprover + √ton vid kontroll av beståndsdelar eller ämnen som troligen är ojämnt fördelade i foder.

6.   KVANTITATIVA KRAV FÖR SAMLINGSPROV

Det krävs ett samlingsprov per provtagen mängd.

	Typ av foder	Minsta storlek på samlingsprov (*8)  (*9)
6.1	Löst foder	4 kg
6.2	Förpackat foder	4 kg (*10)
6.3	Flytande eller halvflytande foder	4 liter
6.4	Foderblock eller saltstenar
6.4.1	med en vikt på mer än 1 kg/styck	4 kg
6.4.2	med en vikt på högst 1 kg/styck	Vikten av fyra block eller stenar i ursprunglig storlek
6.5	Grovfoder/vallfoder	4 kg (*11)

7.   KVANTITATIVA KRAV FÖR SLUTLIGA PROVER

Slutliga prover

Minst ett slutligt prov ska analyseras. Det slutliga prov som analyseras ska vara av minst följande mängd:

Fast foder	500 g (*12)  (*13)  (*14)  (*15)
Flytande eller halvflytande foder	500 ml (*12)

8.   PROVTAGNINGSMETOD FÖR MYCKET STORA PARTIER ELLER PARTIER SOM LAGRAS OCH TRANSPORTERAS PÅ ETT SÄTT SOM INNEBÄR ATT PROVTAGNING PÅ HELA PARTIET ÄR OMÖJLIG

8.1   Allmänna principer

Om det inte är möjligt att ta delprover på hela partiet på grund av det sätt som partiet transporteras eller lagras bör provtagning på sådana partier helst ske när partiet är i flöde.

För stora lagerlokaler avsedda för lagring av foder bör företagarna uppmuntras att installera utrustning i lagerlokalen som möjliggör (automatisk) provtagning på hela det lagrade partiet.

Om man använder de provtagningsförfaranden som anges i denna punkt ska foderföretagaren eller dennes företrädare informeras om provtagningsförfarandet. Om detta provtagningsförfarande ifrågasätts av foderföretagaren eller dennes företrädare ska foderföretagaren eller dennes företrädare ge den behöriga myndigheten möjlighet att provta hela partiet på företagarens bekostnad.

8.2   Stora partier som transporteras med fartyg

8.2.1   Dynamisk provtagning på stora partier som transporteras med fartyg

Provtagning på stora partier på fartyg ska helst ske när produkten är i flöde, dvs. dynamisk provtagning.

Provtagningen ska göras per lastrum (enhet som kan åtskiljas fysiskt). Lastrum töms dock delvis det ena efter det andra, vilket innebär att det ursprungliga fysiska åtskiljandet inte längre föreligger efter att lasten överförts till lagringsanläggningar. Provtagningen kan därför utföras antingen baserat på det ursprungliga fysiska åtskiljandet eller baserat på åtskiljande efter överföring till lagringsanläggningarna.

Lossningen av ett fartyg kan pågå i flera dagar. Normalt ska provtagning ske med jämna mellanrum under hela lossningen. Det är dock inte alltid möjligt eller lämpligt att en officiell inspektör är närvarande för provtagning under hela lossningen. Därför är det tillåtet att provta en del (provtagen mängd) av hela partiet. Antalet delprover fastställs med hänsyn till storleken på den provtagna mängden.

Om provtagning utförs på en del av ett foderparti som ingår i samma kategori eller varuslag, och det har konstaterats att den delen av partiet inte uppfyller EU-kraven, ska man anta att inget foder i detta parti uppfyller kraven, utom om man efter en utförlig bedömning kan konstatera att det inte finns några belägg för att resten av partiet inte uppfyller EU-kraven.

Även om det officiella provet tas automatiskt måste en inspektör vara närvarande. Om den automatiska provtagningen utförs med förinställda parametrar som inte kan ändras under provtagningen och delproverna samlas i ett förseglat kärl, varigenom eventuella bedrägerier förhindras, krävs det enbart att en inspektör är närvarande i början av provtagningen, varje gång provkärlet behöver bytas och i slutet av provtagningen.

8.2.2   Provtagning på partier som transporteras med fartyg genom stationär provtagning

Om provtagningen utförs stationärt ska man tillämpa samma förfarande som föreskrivs för lagringsanläggningar (silor) som kan nås ovanifrån (se punkt 8.4.1).

Provtagningen ska utföras på den (ovanifrån) åtkomliga delen av partiet/lastrummet. Antalet delprover fastställs med hänsyn till storleken på den provtagna mängden. Om provtagning utförs på en del av ett foderparti som ingår i samma kategori eller varuslag, och det har konstaterats att den delen av partiet inte uppfyller EU-kraven, ska man anta att inget foder i detta parti uppfyller kraven, utom om man efter en utförlig bedömning kan konstatera att det inte finns några belägg för att resten av partiet inte uppfyller EU-kraven.

8.3   Provtagning på stora partier som lagras i lagerlokaler

Provtagningen ska utföras på den åtkomliga delen av partiet. Antalet delprover fastställs med hänsyn till storleken på den provtagna mängden. Om provtagning utförs på en del av ett foderparti som ingår i samma kategori eller varuslag, och det har konstaterats att den delen av partiet inte uppfyller EU-kraven, ska man anta att inget foder i detta parti uppfyller kraven, utom om man efter en utförlig bedömning kan konstatera att det inte finns några belägg för att resten av partiet inte uppfyller EU-kraven.

8.4   Provtagning på lagringsanläggningar (silor)

8.4.1   Provtagning på silor som (lätt) kan nås ovanifrån

Provtagningen ska utföras på den åtkomliga delen av partiet. Antalet delprover fastställs med hänsyn till storleken på den provtagna mängden. Om provtagning utförs på en del av ett foderparti som ingår i samma kategori eller varuslag, och det har konstaterats att den delen av partiet inte uppfyller EU-kraven, ska man anta att inget foder i detta parti uppfyller kraven, utom om man efter en utförlig bedömning kan konstatera att det inte finns några belägg för att resten av partiet inte uppfyller EU-kraven.

8.4.2   Provtagning på silor som inte kan nås ovanifrån (slutna silor)

8.4.2.1   Silor som inte kan nås ovanifrån (slutna silor) i storleken > 100 ton

Foder som lagras i sådana silor kan inte provtas stationärt. När fodret i silon måste provtas och det inte finns någon möjlighet att flytta sändningen ska det därför avtalas med företagaren att denne ska informera inspektören om när silon kommer att tömmas för att möjliggöra provtagning på fodret när det är i flöde.

8.4.2.2   Silor som inte kan nås ovanifrån (slutna silor) i storleken < 100 ton

Provtagningsförfarandet innebär att 50–100 kg överförs till ett kärl och att provet tas från detta. Storleken på samlingsprovet överensstämmer med hela partiet och antalet delprover står i relation till den mängd i silon som överförts till ett kärl för provtagning. Om provtagning utförs på en del av ett foderparti som ingår i samma kategori eller varuslag, och det har konstaterats att den delen av partiet inte uppfyller EU-kraven, ska man anta att inget foder i detta parti uppfyller kraven, utom om man efter en utförlig bedömning kan konstatera att det inte finns några belägg för att resten av partiet inte uppfyller EU-kraven.

8.5   Provtagning på löst foder i stora slutna behållare

Sådana partier kan ofta enbart provtas när de lossas. Det är i vissa fall omöjligt att lossa vid importstället eller kontrollstationen och därför bör provtagningen ske när sådana behållare lossas.

9.   ANVISNINGAR FÖR PROVTAGNING, PROVBEREDNING OCH FÖRPACKNING AV PROVER

9.1   Allmänt

Proverna ska tas och beredas utan onödigt dröjsmål med beaktande av de försiktighetsåtgärder som krävs för att produkten varken ska förändras eller kontamineras. Instrument, ytor och behållare som kommer i kontakt med proverna ska vara rena och torra.

9.2   Delprover

Delprover ska tas slumpvis och vara jämnt fördelade i hela den provtagna mängden och ha ungefär samma storlek.

Delprovets storlek ska vara minst 100 gram eller för grovfoder eller vallfoder med låg densitet 25 gram.

Om färre än 40 delprover ska tas enligt bestämmelserna om provtagningsförfarande i punkt 8 ska delprovernas storlek fastställas i förhållande till den storlek som krävs för samlingsprovet (se punkt 6).

Om små partier av förpackat foder provtas, där det enligt de kvantitativa kraven ska tas ett begränsat antal delprover, ska ett delprov utgöras av innehållet i en ursprunglig enhet med ett innehåll på högst 1 kg eller 1 liter.

Om förpackat foder provtas som består av små enheter (t.ex. < 250 g) beror delprovets storlek på enhetens storlek.

När det gäller distansförsäljningsprover beror delprovets storlek på enhetens storlek, och delprovet får i enskilda fall även innehålla mindre än 100 g eller 100 ml.

9.2.1   Löst foder

Provtagningen kan, om så är lämpligt, göras medan den provtagna mängden är i rörelse (vid lastning eller lossning).

9.2.2   Förpackat foder

När det antal enheter som krävs för provtagning enligt punkt 5 har valts ut ska en del av innehållet i varje enhet tas ut med spjut eller skyffel. Vid behov tas proverna efter det att enheterna har tömts separat.

9.2.3   Flytande eller halvflytande foder som är homogent eller kan homogeniseras

När det antal enheter som krävs för provtagning enligt punkt 5 har valts ut ska innehållet vid behov homogeniseras och en mängd tas från varje enhet.

Delproverna får tas när innehållet lossas.

9.2.4   Flytande eller halvflytande foder som inte kan homogeniseras

När det antal enheter som krävs för provtagning enligt punkt 5 har valts ut ska prover tas från olika nivåer.

Proverna får också tas när innehållet lossas, men de första fraktionerna ska då kastas.

I båda fallen ska den totala volymen vara minst tio liter.

9.2.5   Foderblock och saltstenar

När det antal block eller stenar som krävs för provtagning enligt punkt 5 har valts ut får en del av varje block eller sten tas. Om det finns en misstanke om att ett block eller en sten inte är homogen får hela blocket eller stenen tas som prov.

För block eller stenar på högst 1 kg/styck ska ett delprov utgöras av ett block eller en sten.

9.3   Beredning av samlingsprover

Delproverna ska blandas till ett enda samlingsprov.

9.4   Beredning av slutliga prover

Materialet i samlingsprovet ska blandas noggrant (2).

Varje prov ska placeras i en lämplig behållare/ett lämpligt kärl. Alla nödvändiga försiktighetsåtgärder ska vidtas för att undvika att provets sammansättning förändras eller att provet kontamineras eller förfalskas under transport och lagring.

9.4.1   Jämnt fördelade ämnen

Vid kontroll av beståndsdelar eller ämnen som är jämnt fördelade i fodret, får samlingsprovet reduceras representativt till minst 2,0 kg eller 2,0 liter (reducerat prov) (3), helst med mekanisk eller automatisk delare. Vid kontroll av förekomsten av bekämpningsmedelsrester i ärtväxter, sädeskorn och trädnötter ska det reducerade provet vara minst 3 kg. Om fodrets beskaffenhet inte medger användning av delare eller delaren inte är tillgänglig, får provet reduceras med kvarteringsmetoden.

Från samlingsprovet eller de reducerade proverna ska de slutliga proverna (för kontroll, överklagande och möjligen referens) därefter tas och ha ungefär samma storlek samt överensstämma med de kvantitativa kraven i punkt 7.

9.4.2   Ojämnt fördelade ämnen

Vid kontroll av beståndsdelar, inklusive genetiskt modifierade material, eller ämnen som troligen är ojämnt fördelade i foder ska samlingsprovet vara

i)	helt homogeniserat; från det homogeniserade samlingsprovet ska de slutliga proverna (för kontroll, överklagande och möjligen referens) därefter tas och ha ungefär samma storlek samt överensstämma med de kvantitativa kraven i punkt 7, eller

ii)

reducerat till minst 2 kg eller 2 liter (4) med mekanisk eller automatisk delare. Endast om fodrets beskaffenhet inte medger användning av delare får provet vid behov reduceras med kvarteringsmetoden. För kontroll av förekomst av genetiskt modifierat material enligt förordning (EU) nr 619/2011 ska det reducerade provet innehålla minst 35 000 korn/utsäde för att göra det möjligt att erhålla de slutliga proverna för tillsyn, överklagande och möjligen referens på minst 10 000 korn/utsäde (se fotnot ** i punkt 6 och fotnot * i punkt 7).

Från det reducerade provet ska de slutliga proverna därefter tas och ha ungefär samma storlek samt överensstämma med de kvantitativa kraven i punkt 7.

9.5   Förpackning av prover

Behållarna eller förpackningarna ska förseglas och märkas på sådant sätt att de inte kan öppnas utan att förseglingen skadas. Hela märkningen ska ingå i förseglingen. Alternativt kan provet placeras i ett kärl som kan tillslutas på ett sådant sätt att det inte kan öppnas utan att kärlet eller behållaren oåterkalleligt skadas, och återanvändning av kärlet eller behållaren därigenom undviks.

9.6   Sändning av prover till laboratoriet

Provet ska utan onödigt dröjsmål sändas till det utsedda analyslaboratoriet tillsammans med den information som den som utför analysen behöver.

10.   PROVTAGNINGSPROTOKOLL

För varje prov ska ett protokoll upprättas så att varje provtagen mängd och dess storlek entydigt kan identifieras.

I protokollet ska också anges varje avvikelse från det provtagningsförfarande som föreskrivs i denna förordning.

Förutom att protokollet ska hållas tillgängligt för det officiella kontrollaboratoriet, ska det hållas tillgängligt för foderföretagaren och/eller det laboratorium som utsetts av foderföretagaren.

11.   DISTANSFÖRSÄLJNINGSPROV

—

När det gäller ett distansförsäljningsprov ska fodret begäras från foderföretagaren med hjälp av distanskommunikation. När den behöriga myndigheten begär foder på det sättet behöver den inte visa upp någon officiell identitetshandling för foderföretagaren, och myndigheten kan verka under annan identitet.

—

Distansförsäljningsprovets samlingsprov och slutliga prover måste tas av personer behöriga för detta ändamål omedelbart efter mottagandet av sändningen. För att få fram samlingsprovet ska ett lämpligt antal delprover tas slumpmässigt och jämnt fördelat från den erhållna totala mängden och därefter blandas/homogeniseras noggrant, så långt det är möjligt i enlighet med principerna i punkterna 5, 9.2 och 9.3. Om fodret är förpackat i enskilda enheter ska minst ett delprov tas från minst fyra erhållna enheter. Om det från fall till fall visas att de erhållna enheterna kommer från olika partier ska antalet enheter som provtas minskas och enbart omfatta de enheter som kommer från samma parti. Om distansförsäljningsprovet analyseras för beståndsdelar eller ämnen som är ojämnt fördelade i fodret ska antalet delprover vara minst 2,5 gånger högre än för prover som analyseras för ämnen som är jämnt fördelade i fodret. Från samlingsprovet ska motsvarande slutliga prover (för tillsyn, överklagande och möjligen referens) därefter tas så långt det är möjligt i enlighet med principerna i punkt 9.4, och i provtagningsprotokollet anges att provet är ett distansförsäljningsprov. Den behöriga myndigheten underrättar omedelbart foderföretagaren om provtagningen. Foderföretagaren underrättas också om att ett prov (för överklagande) om möjligt hålls tillgängligt av den behöriga myndigheten på en angiven plats för överklagandeändamål eller skickas till foderföretagaren eller det laboratorium som utsetts av foderföretagaren i enlighet med gällande nationella bestämmelser. Om provet skickas direkt till det officiella laboratoriet ska det slutliga provet beredas och förseglas i laboratoriet av personer som bemyndigats för detta ändamål eller i närvaro av sådana personer. När de slutliga proverna har tagits ska distansförsäljningsprovets provtagningsprotokoll omedelbart skickas till den behöriga myndigheten, som underrättar foderföretagaren om provtagningen. Den mängd som foderföretagaren levererar till den behöriga myndigheten anses utgöra en del av ett foderparti i samma kategori eller varuslag. Om det har konstaterats att den delen av partiet inte uppfyller EU-kraven ska man, i enlighet med artikel 15 i Europaparlamentets och rådets förordning (EG) nr 178/2002 (5), även för distansförsäljningsprover anta att inget foder i detta parti uppfyller kraven, utom om man efter en utförlig bedömning (genom inspektion på plats om så är lämpligt) kan konstatera att det inte finns några belägg för att resten av partiet inte uppfyller EU-kraven.

”BILAGA II

ALLMÄNNA BESTÄMMELSER OM ANALYSMETODER FÖR FODER

A.   BEREDNING AV PROVER FÖR ANALYS

1.   Syfte

De förfaranden som beskrivs i denna bilaga gäller beredning för analys av prover som skickats till kontrollaboratorierna efter provtagning i enlighet med bilaga I.

Laboratorieproverna ska beredas så att den uppvägda mängden enligt analysmetoden är homogen och representativ för de slutliga proverna.

Utöver de förfaranden som beskrivs i denna bilaga ska riktlinjerna för provberedning enligt EN ISO 6498 följas.

2.   Försiktighetsåtgärder

Vilket provberedningsförfarande som ska användas beror på analysmetoden och de beståndsdelar eller ämnen som ska kontrolleras. Det är därför viktigt att provberedningsförfarandet lämpar sig för den analysmetod som används och för de beståndsdelar eller ämnen som ska kontrolleras.

Alla nödvändiga moment ska utföras på ett sådant sätt att man i görligaste mån undviker att provet kontamineras eller att dess sammansättning ändras.

Malning, blandning och siktning bör göras utan dröjsmål så att provet i minsta möjliga utsträckning utsätts för luft och ljus. Kvarnar som avsevärt kan hetta upp provet ska inte användas.

Malning för hand rekommenderas för foder som är särskilt känsligt för värme. Man bör också se till att utrustningen i sig inte är en källa till kontaminering.

Homogenisering av provet genom våtmalning för att få en slurry har i vissa fall visat sig ge mer homogena delprover än torr homogenisering/malning, särskilt när det gäller ojämnt fördelade kemiska ämnen. Homogenisering genom tillräcklig torrmalning kan också ge homogena delurval.

I vissa fall, t.ex. vid bestämning av mjöldryga, skadliga botaniska orenheter osv., kan provet inte homogeniseras genom malning utan genom att provet blandas tillräckligt.

Om provet inte kan beredas utan betydande förändringar av dess vattenhalt ska vattenhalten före och efter beredningen bestämmas med den metod som anges i del A i bilaga III.

3.   Förfarande

3.1   Allmänt förfarande

En alikvot tas från det slutliga homogeniserade provet. Koning och kvartering rekommenderas inte eftersom det kan ge alikvoter med större neddelningsfel.

3.1.1   Foder som kan malas i befintligt tillstånd

—	Blanda det slutliga provet och placera det i en lämplig ren, torr behållare med lufttät förslutning. För att garantera fullständig homogenisering blandas provet igen omedelbart innan den alikvot som ska analyseras vägs upp.

3.1.2   Foder som kan malas efter torkning

—	Om inget annat anges för analysmetoden torkas det slutliga provet till en vattenhalt på 8–12 %, enligt det förfarande för förberedande torkning som görs vid bestämning av vattenhalt och som anges i del A punkt 4.3 i bilaga III. Fortsätt sedan enligt punkt 3.1.1.

3.1.3   Flytande eller halvflytande foder

—	Placera det slutliga provet i en lämplig ren, torr behållare med lufttät förslutning. För att garantera fullständig homogenisering blandas provet noggrant omedelbart innan den alikvot som ska analyseras vägs upp.

3.1.4   Övriga foder

—	Slutliga prover som inte kan beredas enligt någon av de föregående förfarandena ska behandlas med något annat förfarande som garanterar att de alikvoter som vägs upp för analys är homogena och representativa för de slutliga proverna.

3.2   Särskilt förfarande vid undersökning genom okulärbesiktning eller genom mikroskopi eller om hela samlingsprovet homogeniserats

—	Vid en undersökning genom okulärbesiktning (utan att använda mikroskop) används hela samlingsprovet eller hela det slutliga provet för undersökningen.

—	Vid undersökning i mikroskop får laboratoriet reducera samlingsprovet eller ytterligare reducera det reducerade provet. De slutliga proverna för överklagandeändamål och möjligen referensändamål tas enligt ett förfarande som motsvarar förfarandet för det slutliga provet för tillsyn.

—	Om hela samlingsprovet homogeniserats ska de slutliga proverna tas från det homogeniserade samlingsprovet.

—

För bestämning av mjöldryga och skadliga botaniska orenheter ska det slutliga provet delas upp i två lika stora delurval på cirka 500 gram. Ett delurval undersöks. Om resultatet från delurvalen är lika med eller under 50 % (analytisk gräns) av gränsvärdet överensstämmer urvalet med gränsvärdet. Om resultatet ligger över 50 % av gränsvärdet ska ytterligare ett delurval undersökas och medelvärdet av resultaten från de två delurvalen användas för att kontrollera överensstämmelsen med gränsvärdet.

4.   Provförvaring

Prover ska förvaras vid en temperatur som inte påverkar deras sammansättning. Prover avsedda för analys av vitaminer eller ämnen som är särskilt ljuskänsliga ska förvaras under sådana förhållanden att de inte påverkas negativt av ljus.

B.   BESTÄMMELSER OM REAGENS OCH UTRUSTNING FÖR ANALYS

1.	Om inget annat anges för analysmetoden ska alla reagens vara analysrena (p.a.). Vid spåranalys ska reagensens renhet kontrolleras mot ett blankprov. Beroende på resultatet kan det krävas ytterligare rening av reagensen.

2.

Om det i analysmetoden inte anges vilken typ av lösnings- eller spädningsmedel som ska användas för beredning av lösningar, spädning, sköljning eller tvättning ska vatten användas. I allmänhet ska vattnet vara demineraliserat eller destillerat. I särskilda fall, som anges för analysmetoden, ska vattnet behandlas med särskilda reningsmetoder.

3.	Eftersom viss utrustning normalt sett förekommer på kontrollaboratorier, nämns i analysmetoden endast instrument och utrustning som är speciella eller som ska användas på ett speciellt sätt. Instrument och utrustning ska vara rena, särskilt när mycket små mängder ska bestämmas.

C.   VAL AV ANALYSMETOD OCH REDOVISNING AV RESULTAT

1.   Extraktion

För flera analysmetoder anges en specifik extraktionsmetod. I allmänhet kan andra extraktionsmetoder än den som anges i metodbeskrivningen användas om det har visats att den använda extraktionsmetoden har likvärdig extraktionseffektivitet för den analyserade matrisen som den metod som anges för analysmetoden.

2.   Upprening

För flera analysmetoder anges en specifik uppreningsmetod. I allmänhet kan andra uppreningsmetoder än den som anges i metodbeskrivningen användas om det har visats att den använda uppreningsmetoden ger likvärdiga analysresultat för den analyserade matrisen som den metod som anges för analysmetoden.

3.   Antal bestämningar

Vid analys av främmande ämnen gäller att om resultatet från den första bestämningen är betydligt (> 50 %) lägre än den specifikation som ska kontrolleras så behövs ingen ytterligare bestämning, förutsatt att lämpliga kvalitetsförfaranden används. Annars behövs två analyser (en andra bestämning) för att utesluta en möjlig intern korskontaminering eller oavsiktlig hopblandning av prover. Medelvärdet av de två bestämningarna används för ytterligare bedömning.

Vid kontroll av högsta eller lägsta halter av fodertillsatser gäller att om resultatet från den första bestämningen är över den lägsta halten eller under den högsta halten så behövs ingen ytterligare bestämning, förutsatt att lämpliga kvalitetsförfaranden används. Annars behövs två analyser (en andra bestämning) för att utesluta en möjlig intern korskontaminering eller oavsiktlig hopblandning av prover. Medelvärdet av de två bestämningarna används för ytterligare bedömning.

Vid kontroll av det deklarerade innehållet av ett ämne eller en ingrediens gäller att om resultatet från den första bestämningen bekräftar det deklarerade innehållet, dvs. analysresultatet ligger inom det deklarerade innehållets acceptabla variationsintervall, behövs ingen ytterligare bestämning, förutsatt att lämpliga kvalitetsförfaranden används. Annars behövs två analyser (en andra bestämning) för att utesluta en möjlig intern korskontaminering eller oavsiktlig hopblandning av prover. Medelvärdet av de två bestämningarna används för ytterligare bedömning (det genomsnittliga analysresultatet ligger inom eller utom det deklarerade innehållets acceptabla variationsintervall).

I en del fall anges detta acceptabla variationsintervall i lagstiftningen såsom i förordning (EG) nr 767/2009 och i Europaparlamentets och rådets förordning (EU) 2019/4 (1).

4.   Rapportering av analysmetod som använts

I analysrapporten ska anges vilken analysmetod som använts.

5.   Rapportering av analysresultat

Analysresultatet ska uttryckas med lämpligt antal signifikanta siffror på det sätt som anges i analysmetoden och ska vid behov korrigeras för vattenhalten i det slutliga provet före beredning.

De flesta föreskrivna halter (t.ex. högsta eller lägsta halt) i EU:s foderlagstiftning fastställs för foder med en vattenhalt på 12 %. För att man i dessa fall ska kunna bedöma det analysresultat som uppmätts i provet i förhållande till den föreskrivna halten måste analysresultatet först divideras med provets torrsubstanshalt (i procent) multiplicerat med 88 enligt formeln

där

Mc	:	provets vattenhalt (i procent), och 100 – Mc således motsvarar provets torrsubstanshalt (i procent),
Rana	:	analysresultat uppmätt i provet,
R12 %	:	resultat för ett foder med en vattenhalt på 12 %, som ska bedömas mot den föreskrivna halten.

Därutöver, om

—	analysresultatet är betydligt (> 50 %) lägre eller högre än den märkningsinformation/specifikation som ska kontrolleras (beroende på om märkningsinformationen/specifikationen är en högsta eller lägsta halt),

—

vattenhalten i det provtagna fodret är känd och det kan fastställas att korrigeringen av vattenhalten inte ändrar bedömningen, kan korrigeringen för vattenhalten utelämnas (t.ex. om det inte finns någon specifikation eller någon föreskriven halt) under förutsättning att lämpliga kvalitetsförfaranden tillämpas och analysen endast syftar till att kontrollera efterlevnaden av rättsliga bestämmelser, såvida inte korrigeringen för vattenhalten är nödvändig för tolkningen.

Om analysresultatet korrigeras för vattenhalten ska motsvarande mätosäkerhet också korrigeras enligt samma förfarande.

Vid bestämning av mjöldryga eller skadliga botaniska orenheter genom visuell/mikroskopisk undersökning behövs ingen korrigering för vattenhalten.

6.   Analytisk mätosäkerhet och utbyte vid analys av främmande ämnen

I fråga om främmande ämnen enligt direktiv 2002/32/EG ska en produkt avsedd som foder inte anses överensstämma med högsta tillåtna halt om analysresultatet som ett genomsnitt av två oberoende bestämningar (för foder med en vattenhalt på 12 %) bedöms överskrida högsta tillåtna halt med hänsyn tagen till den utvidgade analytiska mätosäkerheten beräknad med en täckningsfaktor på 2 vilket ger en konfidensgrad på ca 95 %, och korrigeringen för utbytet. För att bedöma överensstämmelsen använder man således den analyserade halten, korrigerad för utbyte, minus den utvidgade analytiska mätosäkerheten. Detta förfarande är endast tillämpligt i fall där analysmetoden gör det möjligt att uppskatta den utvidgade analytiska mätosäkerheten och korrigeringen för utbytet (exempelvis krävs det inte vid visuell/mikroskopisk undersökning).

Om analysresultatet för det prov som tagits för överklagandeändamål överskrider den högsta tillåtna halten (utan hänsyn till den utvidgade analytiska mätosäkerheten) bekräftar detta den bristande överensstämmelsen med kontrollprovet i avsaknad av särskilda nationella bestämmelser om detta.

Analysresultatet ska rapporteras enligt följande (om analysmetoden gör det möjligt att uppskatta den utvidgade analytiska mätosäkerheten):

a)	Korrigerat för utbyte, när så är lämpligt och relevant, vilket då ska anges. Utbytet ska anges såvida inte korrigering för systematiskt fel (skillnaden mellan det uppmätta värdet och referenskoncentrationen) ingår i förfarandet. Korrigeringen för utbytet är inte nödvändig om utbytet är 90–110 %.

b)	Som x ± U, där x är analysresultatet och U den utvidgade analytiska mätosäkerheten beräknad med en täckningsfaktor på 2 (2), vilket ger en konfidensgrad på ca 95 %.

Om analysresultatet är betydligt (> 50 %) lägre än den specifikation som ska kontrolleras, och förutsatt att lämpliga kvalitetsförfaranden tillämpas och att analysen endast syftar till att kontrollera efterlevnaden av rättsliga bestämmelser, behöver utbyte och utvidgad analytisk mätosäkerhet inte anges (t.ex. om det inte finns någon specifikation eller någon föreskriven halt), såvida inte mätosäkerheten är nödvändig för tolkningen.

7.   Analytisk mätosäkerhet och utbyte vid analys av halten fodertillsatser

För att kontrollera överensstämmelse med lägsta och högsta halter av fodertillsatser ska förekomsten av en fodertillsats inte anses uppfylla kraven på lägsta och högsta halt om analysresultatet som ett genomsnitt av två oberoende bestämningar (för foder med en vattenhalt på 12 %) bedöms

—

överskrida den högsta halten med hänsyn tagen till den utvidgade analytiska mätosäkerheten och korrigeringen för utbytet; för att bedöma om kraven uppfylls använder man således den analyserade halten (dvs. medelvärdet av de två bestämningarna), korrigerad för utbyte, minus den utvidgade analytiska mätosäkerheten,

—

vara lägre än den lägsta halten med hänsyn tagen till den utvidgade analytiska mätosäkerheten och korrigeringen för utbytet. För att bedöma om kraven uppfylls använder man således den analyserade halten (dvs. medelvärdet av de två bestämningarna), korrigerad för utbyte, plus den utvidgade analytiska mätosäkerheten.

Om analysresultatet för det prov som tagits för överklagandeändamål överskrider den högsta tillåtna halten (utan hänsyn till den utvidgade analytiska mätosäkerheten) bekräftar detta den bristande överensstämmelsen med kontrollprovet i avsaknad av särskilda nationella bestämmelser om detta.

Analysresultatet ska rapporteras enligt följande (om analysmetoden gör det möjligt att uppskatta den utvidgade analytiska mätosäkerheten):

a)	Korrigerat för utbyte, när så är lämpligt och relevant, vilket då ska anges. Utbytet ska anges såvida inte korrigering för systematiskt fel (skillnaden mellan det uppmätta värdet och referenskoncentrationen) ingår i förfarandet. Korrigeringen för utbytet är inte nödvändig om utbytet är 90–110 %.

b)	Som x ± U, där x är analysresultatet (medelvärdet av de två bestämningarna) och U den utvidgade analytiska mätosäkerheten beräknad med en täckningsfaktor på 2 (3), vilket ger en konfidensgrad på ca 95 %.

”BILAGA III

ANALYSMETODER FÖR KONTROLL AV FODERRÅVARORS OCH FODERBLANDNINGARS SAMMANSÄTTNING

A.   BESTÄMNING AV VATTENHALT

1.   Syfte och tillämpningsområde

Med denna metod bestäms vattenhalten i foder. Det bör framhållas att när det gäller foder som innehåller flyktiga ämnen, exempelvis organiska syror, bestäms också ett betydande antal flyktiga ämnen tillsammans med vatteninnehållet.

Metoden omfattar inte analys av mjölkprodukter som används som foderråvaror, analys av foderblandningar som främst består av mjölkprodukter, analys av animaliska och vegetabiliska fetter och oljor eller analys av oljeväxtfrön och oljehaltiga frukter.

Vattenhalten i oljeväxtfrön ska bestämmas med den metod som föreskrivs i EN ISO 665 (Bestämning av vattenhalt och flyktiga ämnen), varvid det förutsätts att sojabönor måste malas innan vattenhalten bestäms.

2.   Princip

Provet torkas på angivet sätt, alltefter fodrets beskaffenhet. Viktförlusten bestäms genom vägning. När det gäller fast foder med hög vattenhalt är det nödvändigt att göra en förberedande torkning.

3.   Utrustning

3.1

Kross av ej vattenabsorberande material som är lätt att rengöra, möjliggör snabb och jämn krossning utan nämnvärd värmeutveckling och så långt möjligt förhindrar kontakt med omgivande luft samt som uppfyller kraven i punkterna 4.1.1 och 4.1.2 (t.ex. rivkvarnar med variabel malning, vattenkylda kvarnar eller liknande).

3.2	Analysvåg med en noggrannhet av 1 mg.

3.3	Torra behållare av korrosionsfri metall eller av glas och med lufttäta lock. Arbetsytan ska göra det möjligt att sprida ut provet till ca 0,3 g/cm2.

3.4	Elektrisk isotermisk ugn (± 2 °C) med god ventilation och möjlighet till snabb temperaturreglering (1).

3.5	Reglerbar elektrisk vakuumugn med oljepump och antingen en anordning för tillförsel av varm, torr luft eller ett torkmedel (t.ex. kalciumoxid).

3.6	Exsickator med tjock perforerad metall- eller porslinsplatta och med ett effektivt torkmedel.

4.   Förfarande

Anm.:

De moment som beskrivs i detta avsnitt måste utföras omedelbart efter det att provförpackningarna öppnats. Minst dubbelprover ska analyseras.

4.1   Beredning

4.1.1   Andra fodertyper än de som behandlas i punkterna 4.1.2 och 4.1.3:

Ta minst 50 g av provet. Krossa eller sönderdela vid behov för att göra provet homogent med avseende på vattenhalt (se punkt 6).

4.1.2   Spannmål och gröpe:

Ta minst 50 g av provet. Mal till partiklar som till minst 50 % passerar genom en sikt med en maskvidd av 0,5 mm och som lämnar högst 10 % återstod på en rundmaskig sikt med en maskvidd av 1 mm.

4.1.3   Foder i flytande form eller pastaform samt foder som till större delen består av oljor och fetter:

Väg med en noggrannhet av 10 mg upp ca 25 g prov. Tillsätt lämplig mängd vattenfri sand som vägts med en noggrannhet av 10 mg och blanda tills en homogen massa erhålls.

4.2   Torkning

Torka en behållare (punkt 3.3) med lock i ugnen inställd på 103 °C i 30 min ± 1 min. Ta ut behållaren ur ugnen och låt den svalna till rumstemperatur i exsickatorn (punkt 3.6).

4.2.1   Andra fodertyper än de som behandlas i punkterna 4.2.2 och 4.2.3:

Väg behållaren med lock med en noggrannhet av 1 mg. Väg med en noggrannhet av 1 mg upp ca 5 g prov i den vägda behållaren och fördela det jämnt. Sätt in behållaren utan lock i ugnen som förvärmts till 103 °C. Sätt in behållaren i ugnen så snabbt som möjligt så att ugnstemperaturen inte sjunker alltför mycket. Låt torka i fyra timmar räknat från det att ugnstemperaturen åter stigit till 103 °C. Öppna ugnen, sätt omedelbart locket på behållaren, ta ut den ur ugnen, låt den svalna i 30–45 minuter i exsickatorn (punkt 3.6) och väg med en noggrannhet av 1 mg.

Foder som till större delen (> 50 %) består av oljor och fetter av animaliskt och vegetabiliskt ursprung torkas i ugnen i ytterligare 30 minuter vid 103 °C. Skillnaden i vattenhalt mellan de båda vägningarna får inte överskrida 0,1 %.

4.2.2   Spannmål, mjöl och gröpe:

Väg behållaren med lock med en noggrannhet av 0,5 mg. Väg med en noggrannhet av 1 mg upp ca 5 g av det krossade provet i den vägda behållaren och fördela det jämnt. Sätt in behållaren utan lock i ugnen som förvärmts till 130 °C. Sätt in behållaren i ugnen så snabbt som möjligt så att ugnstemperaturen inte sjunker alltför mycket. Låt torka i två timmar räknat från det att ugnstemperaturen åter stigit till 130 °C. Öppna ugnen, sätt omedelbart locket på behållaren, ta ut den ur ugnen, låt den svalna i 30–45 minuter i exsickatorn (punkt 3.6) och väg med en noggrannhet av 1 mg.

4.2.3   Foderblandningar som innehåller mer än 4 % sackaros eller laktos: foderråvaror som t.ex. johannesbrödsfrön, hydrolyserade spannmålsprodukter, malt, torkad betsnitsel, lösliga biprodukter från fisk- eller sockerindustrin

Väg behållaren med lock med en noggrannhet av 0,5 mg. Väg med en noggrannhet av 1 mg upp ca 5 g prov i den vägda behållaren och fördela det jämnt. Sätt in behållaren utan lock i vakuumugnen (punkt 3.5) som förvärmts till 80–85 °C. Sätt in behållaren i ugnen så snabbt som möjligt så att ugnstemperaturen inte sjunker alltför mycket.

Ställ in trycket på 100 torr och låt torka vid detta tryck i fyra timmar, antingen med en torr varmluftsström eller med användning av torkmedel (ca 300 g till 20 prover). Om det senare alternativet väljs ska vakuumpumpen frånkopplas när det angivna trycket har uppnåtts. Räkna torkningstiden från det att ugnstemperaturen åter stigit till 80–85 °C. Låt försiktigt ugnen återgå till atmosfärstryck. Öppna ugnen, sätt omedelbart locket på behållaren, ta ut den ur ugnen, låt den svalna i 30–45 minuter i exsickatorn (punkt 3.6) och väg med en noggrannhet av 1 mg. Låt torka i ytterligare 30 minuter i vakuumugnen vid 80–85 °C och väg på nytt. Skillnaden i vattenhalt mellan de båda vägningarna får inte överskrida 0,1 %.

4.3   Förberedande (partiell) torkning

Blötfoder med ett massförhållande på mindre än 85 % torrsubstans (t.ex. vallfoder, totalt blandat dagsbehov, icke-flytande foder) behöver vid analys av stabila ämnen torkas partiellt före finmalning. För instabila ämnen är partiell torkning inte möjlig.

Partiell torkning kan utföras med antingen ett fläkttorkskåp eller en mikrovågsugn eller genom frystorkning. Med undantag för partiell torkning genom frystorkning är syftet att torka fodret samtidigt som provets temperatur hålls under 60 °C så att den kemiska sammansättningen påverkas så lite som möjligt. Torkning vid temperaturer över 60 °C orsakar kemiska förändringar i fodret (t.ex. proteinnedbrytning). Det torkade fodret ska jämviktas vid rumstemperatur i ca 15 minuter innan partiell torrsubstans mäts, för att minimera den potentiella förändring av vattenhalten som kan inträffa vid malning och lagring. Torkning vid temperaturer under 60 °C avlägsnar inte allt vatten från fodret. Den (inledande) partiella torkningen motsvarar därför inte fodrets totala torrsubstans. Efter torkning av delurvalet mals det ned och analyseras för (slutlig) torrsubstans av det partiellt torkade provet (3–15 % resterande vattenhalt) då andra kemiska beståndsdelar bestäms.

Därför rekommenderas ett förfarande i två steg för bestämning av torrsubstans. Bestäm först den partiella torrsubstanshalten (om mindre än 85 % torrsubstans), och bestäm därefter den resterande torrsubstanshalten på ett malet prov och multiplicera den partiella torrsubstansen med den resterande torrsubstansen för att bestämma den totala torrsubstanshalten.

5.   Beräkning av resultat

Provets vattenhalt (X) i procent beräknas med nedanstående formler.

5.1   Torkning utan förberedande torkning

där

m	=	provets ursprungliga vikt i gram,
m0	=	det torkade provets vikt i gram.

5.2   Torkning med förberedande torkning (2)

där

m	=	provets ursprungliga vikt i gram,
m1	=	provets vikt i gram efter förberedande torkning,
m2	=	provets vikt i gram efter krossning eller malning,
m0	=	det torkade provets vikt i gram.

5.3   Repeterbarhet

Skillnaden mellan resultaten från två parallella bestämningar som utförs på samma prov får inte överskrida 0,2 % av den absoluta vattenhalten, utom när det gäller våtfoder för sällskapsdjur och tuggben, där skillnaden inte får överskrida 0,5 % av den absoluta vattenhalten.

6.   Anmärkning

Om det är nödvändigt att krossa provet och detta medför en förändring av vattenhalten, ska analysresultaten för fodrets beståndsdelar korrigeras på grundval av provets ursprungliga vattenhalt.

B.   BESTÄMNING AV VATTENHALT I ANIMALISKA OCH VEGETABILISKA OLJOR OCH FETTER

1.   Syfte och tillämpningsområde

Med denna metod bestäms halten vatten och flyktiga ämnen i animaliska och vegetabiliska oljor och fetter.

2.   Princip

Provet torkas till konstant vikt vid 103 °C (viktförlusten mellan två på varandra följande vägningar får inte överskrida 1 mg). Viktförlusten bestäms genom vägning.

3.   Utrustning

3.1	Flatbottnad skål av korrosionsresistent material, 8–9 cm i diameter och ca 3 cm hög.

3.2	Termometer med förstärkt kula och expansionsrör i överdelen, graderad från ca 80 °C till minst 110 °C och ca 10 cm lång.

3.3	Sandbad eller elektrisk värmeplatta.

3.4	Exsickator med ett effektivt torkmedel.

3.5	Analysvåg.

4.   Förfarande

Väg med 1 mg noggrannhet upp ca 20 g av det homogeniserade provet i den torra, vägda skålen (punkt 3.1) där termometern (punkt 3.2) placerats. Upphetta på sandbadet eller värmeplattan (punkt 3.3) under ständig omrörning med termometern så att temperaturen stiger till 90 °C på ca 7 minuter.

Sänk värmen och ge akt på mängden bubblor som stiger från skålens botten. Temperaturen får inte överskrida 105 °C. Fortsätt att röra om och skrapa skålens botten tills det inte längre bildas några bubblor.

För att säkerställa att vattnet helt har avlägsnats hettas skålen upp upprepade gånger till 103 (± 2) °C och kyls till 93 °C mellan upphettningarna. Därefter får provet svalna till rumstemperatur i exsickatorn (punkt 3.4) varefter det vägs. Detta upprepas tills viktförlusten mellan två på varandra följande vägningar inte längre överskrider 2 mg.

Anm.:

Om provets vikt ökar efter flera upphettningar, tyder detta på att fettet har oxiderat. Resultatet beräknas då utifrån den vägning som gjordes omedelbart innan vikten började öka.

5.   Beräkning av resultat

Provets vattenhalt (X) i procent beräknas med formeln

där

m	=	provets vikt i gram,
m1	=	skålens vikt i gram inklusive innehåll före upphettning,
m2	=	skålens vikt i gram inklusive innehåll efter upphettning.

Resultat under 0,05 % ska redovisas som ’under 0,05 %’.

Repeterbarhet

Skillnaden mellan resultaten från två parallella bestämningar som utförs på samma prov får inte överskrida 0,1 % av den absoluta vattenhalten.

C.   BESTÄMNING AV KVÄVEHALT OCH BERÄKNING AV RÅPROTEINHALT

1.   Syfte och tillämpningsområde

Med denna metod bestäms råproteinhalten i foder på grundval av kvävehalten, bestämd med Kjeldahlmetoden (3).

2.   Princip

Provet uppsluts med svavelsyra i närvaro av en katalysator. Syralösningen görs basisk med natriumhydroxidlösning. Ammoniaken destilleras av och samlas upp i en uppmätt mängd svavelsyra varefter syraöverskottet titreras med en standardlösning av natriumhydroxid.

Alternativt destilleras den frigjorda ammoniaken till ett överskott av borsyralösning, som sedan titreras med saltsyra eller svavelsyra.

3.   Reagens

3.1	Kaliumsulfat.

3.2	Katalysator: koppar(II)oxid (CuO) eller koppar(II)sulfatpentahydrat (CuSO4 5H2O).

3.3	Zinkgranulat.

3.4	Svavelsyra, ρ20 = 1,84 g/ml.

3.5	Svavelsyra, standardlösning, c(H2SO4) = 0,25 mol/l.

3.6	Svavelsyra, standardlösning, c(H2SO4) = 0,10 mol/l.

3.7	Svavelsyra, standardlösning, c(H2SO4) = 0,05 mol/l.

3.8	Metylrött (indikator): lös 300 mg metylrött i 100 ml etanol, σ = 95–96 % (v/v).

3.9	Natriumhydroxidlösning (teknisk kvalitet kan användas) β = 40 g/100 ml (m/v: 40 %).

3.10	Natriumhydroxid, standardlösning, c(NaOH) = 0,25 mol/l.

3.11	Natriumhydroxid, standardlösning, c(NaOH) = 0,10 mol/l.

3.12	Pimpstensgranulat som sköljts i saltsyra och glödgats.

3.13	Acetanilid (smältpunkt = 114 °C, N-halt = 10,36 %).

3.14	Sackaros (kvävefri).

3.15	Borsyra (H3BO3).

3.16	Indikatorlösning av metylrött: lös 100 mg metylrött i 100 ml etanol eller metanol.

3.17	Lösning av bromkresolgrönt: lös 100 mg bromkresolgrönt i 100 ml etanol eller metanol.

3.18

Borsyralösning (10–40 g/l beroende på vilken utrustning som används). Vid kolorimetrisk bestämning av ekvivalenspunkt ska indikatorerna metylrött och bromkresolgrönt tillsättas borsyralösningen. För beredning av 1 liter borsyralösning tillsätts 7 ml indikatorlösning av metylrött (punkt 3.16) och 10 ml lösning av bromkresolgrönt (punkt 3.17) innan volymen justeras. Beroende på det vatten som används kan borsyralösningens pH variera mellan olika satser. Borsyralösningens pH ska vara mellan 4,3 och 4,7. Det är ofta nödvändigt med en liten tillsats av bas för att få ett positivt blankprov. Anm.: En tillsats av ca 3–4 ml NaOH (punkt 3.11) till 1 liter borsyra (10 g/l) ger vanligen en god justering. Lösningen förvaras i rumstemperatur skyddad från ljus och ammoniakångor.

3.19	Saltsyra, standardlösning, c(HCl) = 0,10 mol/l. Anm.: Andra koncentrationer av lösningarna (punkterna 3.5, 3.6, 3.7, 3.10, 3.11 och 3.19) kan användas om beräkningarna korrigeras för detta. Koncentrationerna bör alltid anges med fyra decimaler.

4.   Utrustning

Lämplig utrustning för uppslutning, destillation och titrering enligt Kjeldahlmetoden.

5.   Förfarande

5.1   Uppslutning

Väg med en noggrannhet av 0,001 g upp 1 g av provet och överför detta till en flaska för uppslutning. Tillsätt 15 g kaliumsulfat (punkt 3.1), en lämplig mängd katalysator (punkt 3.2) (0,3–0,4 g koppar(II)oxid eller 0,9–1,2 g koppar(II)sulfatpentahydrat), 25 ml svavelsyra (punkt 3.4) och vid behov några korn pimpsten (punkt 3.12). Blanda.

Upphetta flaskan först måttligt, och rotera den vid behov då och då tills innehållet har förkolnat och skummet försvunnit. Upphetta sedan intensivare tills vätskan kommit i konstant kokning. Värmen är tillräcklig om den kokande syran kondenserar på flaskans väggar. Se till att flaskans väggar inte blir överhettade och att organiska partiklar inte fastnar på dem.

När lösningen har blivit klar och ljusgrön fortsätts kokningen i ytterligare två timmar, varefter lösningen får svalna.

5.2   Destillation

Tillsätt försiktigt tillräckligt med vatten för att sulfaterna ska lösas upp fullständigt. Låt svalna. Tillsätt sedan vid behov några korn zinkgranulat (punkt 3.3). Fortsätt enligt punkt 5.2.1 eller 5.2.2.

5.2.1   Destillation till svavelsyra

Tillför en exakt uppmätt mängd av 25 ml svavelsyra (punkt 3.5 eller 3.7 beroende på den förmodade kvävehalten) till destillationsapparatens uppsamlingskolv. Tillsätt några droppar metylrött (punkt 3.8).

Koppla samman flaskan för uppslutning med destillationsapparatens kylare och sänk ned kylarens ände minst 1 cm (se punkt 8.3) i vätskan i uppsamlingskolven. Häll långsamt 100 ml natriumhydroxidlösning (punkt 3.9) i flaskan för uppslutning utan att ammoniak försvinner (se punkt 8.1). Upphetta flaskan tills ammoniaken har destillerats färdigt.

5.2.2   Destillation till borsyra

Om destillatets ammoniakinnehåll titreras manuellt används nedanstående förfarande. Om destillationsenheten är helautomatisk och inkluderar titrering av destillatets ammoniakinnehåll, ska tillverkarens bruksanvisning följas.

Ställ en uppsamlingskolv innehållande 25–30 ml borsyralösning (punkt 3.18) under kylarens utlopp på ett sådant sätt att utloppsröret mynnar under ytan i ett överskott av borsyralösning. Ställ in destillationsenheten så att 50 ml natriumhydroxidlösning (punkt 3.9) tillsätts. Använd destillationsenheten enligt tillverkarens bruksanvisning och destillera bort den ammoniak som frigjorts genom tillsatsen av natriumhydroxidlösning. Samla upp destillatet i borsyralösningen. Mängden destillat (tiden för ångdestillation) beror på mängden kväve i provet. Följ tillverkarens bruksanvisning.

Anm.:

I en halvautomatisk destillationsenhet sker såväl tillsats av ett överskott av natriumhydroxid som ångdestillation automatiskt.

5.3   Titrering

Fortsätt enligt punkt 5.3.1 eller 5.3.2.

5.3.1   Svavelsyra

Överskottet av svavelsyra i uppsamlingskolven titreras med natriumhydroxidlösning (punkt 3.10 eller 3.11 beroende på vilken koncentration av svavelsyra som använts) tills ekvivalenspunkten är nådd.

5.3.2   Borsyra

Uppsamlingskolvens innehåll titreras med standardlösningen av saltsyra (punkt 3.19) eller med standardlösningen av svavelsyra (punkt 3.6) med hjälp av en byrett. Avläs den använda mängden titrator.

Vid kolorimetrisk bestämning av ekvivalenspunkten nås denna så snart provet börjar skifta färg till rosa. Avläs byretten med en noggrannhet av 0,05 ml. En upplyst magnetomrörare eller en fotometer kan göra det lättare att påvisa färgomslaget.

Detta kan också göras automatiskt med hjälp av en ångdestillationsapparat med automatisk titrering.

Följ tillverkarens bruksanvisning för den använda destillationsapparaten eller destillations-/titreringsapparaten.

Anm.:

Om automatisk titrering används, inleds titreringen omedelbart efter det att destillationen har börjat, och 1 % borsyralösning (punkt 3.18) används.

Med en helautomatisk destillationsenhet kan man också göra en potentiometrisk titrering av ammoniak, där ekvivalenspunkten bestäms genom kontinuerlig pH-mätning.

I så fall används en automatisk titreringsapparat med en pH-meter som med hjälp av standardmetoder är noggrant kalibrerad i intervallet pH 4–7.

Ekvivalenspunkten nås vid pH 4,6 där titrerkurvan är som brantast (inflexionspunkt).

5.4   Blankprov

För att säkerställa att reagensen är fria från kväve utförs ett blankprov (uppslutning, destillation och titrering) med 1 g sackaros (punkt 3.14) i stället för provet.

6.   Beräkning av resultat

Beräkningarna görs enligt punkt 6.1 eller 6.2.

6.1   Beräkning för titrering enligt punkt 5.3.1

Råproteinhalten i viktprocent beräknas med formeln

där

V0	=	volymen (ml) NaOH (punkt 3.10 eller 3.11) i blankprovet,
V1	=	volymen (ml) NaOH (punkt 3.10 eller 3.11) vid titreringen av provet,
c	=	koncentrationen (mol/l) NaOH (punkt 3.10 eller 3.11),
m	=	provets vikt (g).

6.2   Beräkning för titrering enligt punkt 5.3.2

6.2.1   Titrering med saltsyra

Råproteinhalten i viktprocent beräknas med formeln

där

m	=	provets vikt (g),
c	=	koncentrationen (mol/l) saltsyra i standardlösningen (punkt 3.19),
V0	=	volymen (ml) saltsyra i blankprovet,
V1	=	volymen (ml) saltsyra i provet.

6.2.2   Titrering med svavelsyra

Råproteinhalten i viktprocent beräknas med formeln

där

m	=	provets vikt (g),
c	=	koncentrationen (mol/l) svavelsyra i standardlösningen (punkt 3.6),
V0	=	volymen (ml) svavelsyra (punkt 3.6) i blankprovet,
V1	=	volymen (ml) svavelsyra (punkt 3.6) i provet.

7.   Verifiering av metoden

7.1   Repeterbarhet

Skillnaden mellan resultaten från två parallella bestämningar som utförs på samma prov får inte överskrida

—	0,4 % (absolut värde) för råproteinhalter under 20 %,

—	2,0 % av det högre värdet för råproteinhalter på 20–40 %,

—	0,8 % (absolut värde) för råproteinhalter över 40 %.

7.2   Reproducerbarhet

Skillnaden mellan resultaten från två bestämningar som utförs på samma prov i olika laboratorier får inte överskrida

—	1,8 % (absolut värde) för råproteinhalter under 20 %,

—	9,0 % av det högre värdet för råproteinhalter på 20–40 %,

—	3,6 % (absolut värde) för råproteinhalter över 40 %.

7.3   Noggrannhet

Utför analysen (uppslutning, destillation och titrering) på en lämplig mängd acetanilid (punkt 3.13) (t.ex. 0,2–0,3 g) i närvaro av 1 g sackaros (punkt 3.14). 1 g acetanilid förbrukar 14,80 ml svavelsyra (punkt 3.5). Utbytet ska vara minst 99 %.

8.   Anmärkningar

8.1

Den använda utrustningen kan vara manuell, halvautomatisk eller automatisk. Om utrustningen kräver att materialet överförs mellan uppslutnings- och destillationsstegen ska överföringen ske utan förlust. Om destillationsapparatens kolv inte är försedd med en dropptratt ska natriumhydroxiden tillsättas omedelbart innan kolven ansluts till kylaren, varvid vätskan långsamt hälls ned längs kolvens vägg.

8.2	Om det uppslutna materialet tjocknar görs bestämningen om med en större mängd svavelsyra (punkt 3.4) än den som anges i punkt 5.1.

8.3	För produkter med låg kvävehalt kan volymen svavelsyra (punkt 3.7) som tillsätts i uppsamlingskolven vid behov minskas till 10 eller 15 ml, varefter vatten fylls på till 25 ml.

8.4

För rutinanalyser kan alternativa metoder för bestämning av råprotein användas, men Kjeldahlmetoden som beskrivs i denna del C är referensmetoden. De resultat som erhålls med den alternativa metoden (t.ex. Dumas) ska för varje matris individuellt visas vara likvärdiga jämfört med referensmetoden. Resultaten kan dock skilja sig något från resultat erhållna med referensmetoden, även om likvärdigheten har kontrollerats. Därför måste analysrapporten ange vilken metod som använts för bestämning av råprotein.

D.   BESTÄMNING AV UREA

1.   Syfte och tillämpningsområde

Med denna metod bestäms den halt urea som används som fodertillsats i idisslarfoder.

2.   Princip

Provet slammas upp i vatten med klarmedel. Suspensionen filtreras. Ureahalten i filtratet bestäms efter tillsats av 4-dimetylaminobensaldehyd (4-DMAB) genom mätning av absorbansen vid våglängden 420 nm.

3.   Reagens

3.1	Lösning av 4-dimetylaminobensaldehyd: lös 1,6 g 4-DMAB i 100 ml 96 % etanol och tillsätt 10 ml saltsyra (ρ20 = 1,19 g/ml). Denna reagens håller sig i högst två veckor.

3.2	Carrez-lösning I: lös 21,9 g zinkacetat (Zn(CH3COO)2 2H2O) och 3 g isättika i vatten. Späd med vatten till 100 ml.

3.3	Carrez-lösning II: lös 10,6 g kaliumferrocyanid (K4Fe(CN)6·3H2O) i vatten. Späd med vatten till 100 ml.

3.4	Aktivt kol som inte absorberar urea (ska kontrolleras).

3.5	Urea, 0,1 % lösning (w/v).

4.   Utrustning

4.1	Omblandare: ca 35–40 varv per minut.

4.2	Provrör: 160 × 16 mm med slipade glasproppar.

4.3	Spektrofotometer.

5.   Förfarande

5.1   Analys av provet

Väg med en noggrannhet av 1 mg upp 2 g av provet i en 500 ml mätkolv tillsammans med 1 g aktivt kol (punkt 3.4). Tillsätt 400 ml vatten och 5 ml Carrez-lösning I (punkt 3.2), blanda i ca 30 sekunder och tillsätt 5 ml Carrez-lösning II (punkt 3.3). Blanda i 30 minuter på skakapparaten. Späd med vatten till full volym, skaka och filtrera.

För över 5 ml av de transparenta, färglösa filtraten till provrör med slipade glasproppar, tillsätt 5 ml 4-DMAB-lösning (punkt 3.1) och blanda. Ställ provrören i ett vattenbad som håller 20 (±4) °C. Mät efter 15 minuter provlösningens absorbans med spektrofotometer vid 420 nm. Jämför med reagensens blankprov.

5.2   Kalibreringskurva

För över 1, 2, 4, 5 och 10 ml urealösning (punkt 3.5) till 100 ml mätkolvar och späd med vatten till full volym. Avlägsna 5 ml från varje lösning, tillsätt 5 ml 4-DMAB-lösning (punkt 3.1) till var och en av dem, homogenisera och mät absorbansen enligt ovan jämfört med en kontrollösning som innehåller 5 ml 4-DMAB-lösning och 5 ml ureafritt vatten. Konstruera kalibreringskurvan.

6.   Beräkning av resultat

Bestäm ureahalt i provet med hjälp av kalibreringskurvan.

Uttryck resultatet i milligram urea per kg prov.

7.   Utvärdering av metoden

7.1   Repeterbarhet

Skillnaden mellan resultaten från två bestämningar som utförs på samma prov i samma laboratorium och av samma aktör får inte överskrida

—	vid 420 nm — 50 % av det högre värdet för ureahalter från 3 000 mg/kg till mindre än 5 000 mg/kg. — 25 % av det högre värdet för ureahalter från 5 000 mg/kg till mindre än 7 000 mg/kg. — 20 % av det högre värdet för ureahalter på minst 7 000 mg/kg.

—	vid 435 nm — 40 % av det högre värdet för ureahalter från 3 000 mg/kg till mindre än 5 000 mg/kg. — 25 % av det högre värdet för ureahalter från 5 000 mg/kg till mindre än 9 000 mg/kg. — 5 % av det högre värdet för ureahalter på minst 9 000 mg/kg.

7.2   Reproducerbarhet

Skillnaden mellan resultaten från två bestämningar som utförs på samma prov i olika laboratorier och/eller av olika aktörer får inte överskrida

—	vid 420 nm — 3 000 mg/kg (absolut värde) för ureahalter från 3 000 mg/kg till mindre än 12 000 mg/kg. — 4 500 mg/kg (absolut värde) för ureahalter på minst 12 000 mg/kg.

—	vid 435 nm — 50 % av det högre värdet för ureahalter från 3 000 mg/kg till mindre än 8 000 mg/kg. — 25 % av det högre värdet för ureahalter på minst 8 000 mg/kg.

8.   Resultat av en kollaborativ avprövning

18 laboratorier deltog i en provningsjämförelse mellan laboratorier i EU. Fem positiva prover på foderblandning för idisslare (MAT i tabellerna 1 och 2) analyserades (1 analys) i dubbelblindprover, medan ett blankprov på foderblandning för idisslare analyserades en gång.

Beräkningar av gränsvärden för repeterbarhet (r) och reproducerbarhet (R) enligt internationella riktlinjer gjordes efter eliminering av extremvärden med hjälp av variansanalys av giltiga värden.

De beräknade värdena för metodens prestanda (repeterbarhet, reproducerbarhet) presenteras i följande tabeller. I alla testade prover, inklusive blankmaterialet, hittades inga falskt positiva eller falskt negativa resultat.

Tabell 1

Metodens prestanda för urea mätt vid λ = 420 nm i alla material

	MAT 2	MAT 5	MAT 3	MAT 4	MAT 6
	Får	Nötkreatur	Får	Får	Nötkreatur
Målmassförhållande (mg kg–1)	3 000	5 000	7 001	9 036	11 000
Genomsnittligt massförhållande (mg kg–1)	4 241	6 993	7 830	9 962	12 071
Standardavvikelse för reproducerbarhet sR (mg kg-1)	1 141	1 303	985	994	1 711
Standardavvikelse för repeterbarhet sr (mg kg-1)	723	601	549	712	737
Relativ standardavvikelse för reproducerbarhet RSDR (%)	27	19	13	10	14
Relativ standardavvikelse för repeterbarhet RSDr (%)	17	9	7	7	6
Reproducerbarhetsgräns, R [R = 2,8 × sR ]	3 195	3 649	2 759	2 784	4 790
Repeterbarhetsgräns, r [r = 2,8 × sr ]	2 024	1 684	1 536	1 994	2 064

Tabell 2

Metodens prestanda för urea mätt vid λ = 435 nm i alla material

	MAT 2	MAT 5	MAT 3	MAT 4	MAT 6
	Får	Nötkreatur	Får	Får	Nötkreatur
Målmassförhållande (mg kg–1)	3 000	5 000	7 001	9 036	11 000
Genomsnittligt massförhållande (mg kg–1)	4 101	6 467	7 890	10 062	11 642
Standardavvikelse för reproducerbarhet sR (mg kg–1)	706	1 194	675	745	1 378
Standardavvikelse för repeterbarhet sr (mg kg–1)	570	628	613	196	167
Relativ standardavvikelse för reproducerbarhet RSDR (%)	17	18	9	7	12
Relativ standardavvikelse för repeterbarhet RSDr (%)	14	10	8	2	1
Reproducerbarhetsgräns, R [R = 2,8 × sR ]	1 977	3 344	1 889	2 087	3 859
Repeterbarhetsgräns, r [r = 2,8 × sr ]	1 596	1 759	1 715	549	467

9.   Anmärkningar

9.1	Om ureahalten överskrider 3 %, reducera provet till 1 g eller späd den ursprungliga lösningen så att det inte finns mer än 50 mg urea per 500 ml.

9.2	Om ureahalten är låg, öka provmängden så mycket som kan ske med bibehållen transparens och färglöshet hos filtratet.

9.3	Ovanstående resultat från den kollaborativ avprövningen ger ingen betydande skillnad i precision mellan urea uppmätt vid 420 nm eller 435 nm.

E.   BESTÄMNING AV AMINOSYROR (UTOM TRYPTOFAN)

Följande analysmetoder ska användas för bestämning av aminosyror (utom tryptofan):

—	EN ISO 13903 (Djurfoder – Bestämning av halten aminosyror).

—	EN ISO 17180 (Djurfoder – Bestämning av lysin, metionin och treonin i kommersiella aminosyreprodukter och förblandningar) (4).

—	Den analysmetod som beskrivs i punkterna 1–10 nedan.

1.   Syfte och tillämpningsområde

Med denna metod bestäms halten fria aminosyror (syntetiska och naturliga) och totalhalten aminosyror (peptidbundna och fria) i foderråvaror, foderblandningar och förblandningar som innehåller mindre än 10 % (5) av varje aminosyra, med hjälp av en aminosyraanalysator. Den är tillämplig på följande aminosyror: cyst(e)in, metionin, lysin, treonin, alanin, arginin, asparaginsyra, glutaminsyra, glycin, histidin, isoleucin, leucin, fenylalanin, prolin, serin, tyrosin och valin.

Metoden skiljer inte mellan aminosyrornas olika salter och kan inte skilja mellan aminosyrornas D- och L-former. Den är inte användbar för bestämning av tryptofan eller hydroxianaloger av aminosyror.

2.   Princip

2.1   Fria aminosyror

De fria aminosyrorna extraheras med utspädd saltsyra. Samextraherade kvävehaltiga makromolekyler fälls ut med sulfosalicylsyra och avlägsnas genom filtrering. Den filtrerade lösningens pH justeras till 2,20. Aminosyrorna separeras genom jonbyteskromatografi och bestäms fotometriskt vid 570 nm genom reaktion med ninhydrin.

2.2   Totalhalt aminosyror

Valet av förfarande beror på vilka aminosyror som ska bestämmas. Cyst(e)in och metionin måste oxideras till cysteinsyra respektive metioninsulfon före hydrolys. Tyrosin ska bestämmas i hydrolysat av ooxiderade prover. Alla övriga aminosyror som förtecknas i punkt 1 (Syfte och tillämpningsområde) kan bestämmas i antingen det oxiderade eller ooxiderade provet.

Oxidation utförs vid 0 °C med en blandning av permyrsyra och fenol. Överskott av oxidationsreagens avlägsnas genom tillsats av natriumdisulfit. Det oxiderade eller ooxiderade provet hydrolyseras med saltsyra (punkt 3.20) i 23 timmar. Hydrolysatet justeras till pH 2,20. Aminosyrorna separeras genom jonbyteskromatografi och bestäms fotometriskt vid 570 nm (440 nm för prolin) genom reaktion med ninhydrin.

3.   Reagens

Dubbeldestillerat vatten eller vatten av likvärdig kvalitet ska användas (konduktivitet < 10μS).

3.1	Väteperoxid, w = 30 % (w/w).

3.2	Myrsyra, w = 98-100 % (w/w).

3.3

Fenol.

3.4	Natriumdisulfit

3.5	Natriumhydroxid.

3.6	5-Sulfosalicylsyradihydrat.

3.7	Saltsyra, densitet ca 1,18 g/ml.

3.8	Trinatriumcitratdihydrat.

3.9	2,2’-Tiodietanol (tiodiglykol).

3.10	Natriumklorid.

3.11	Ninhydrin.

3.12	Petroleumeter, kokpunktsintervall 40–60 °C.

3.13	Norleucin eller annan förening lämplig som intern standard.

3.14	Kvävgas (< 10 ppm syrgas).

3.15	1-Oktanol.

3.16	Aminosyror:

3.16.1

Referenssubstanser av de aminosyror som förtecknas i punkt 1 (Syfte och tillämpningsområde). Rena föreningar, fria från kristallvatten. Torka i vakuum över P2O5 eller H2SO4 i 1 vecka före användning.

3.16.2

Cysteinsyra.

3.16.3

Metioninsulfon.

3.17	Natriumhydroxidlösning, c = 7,5 mol/l: Lös 300 g NaOH (punkt 3.5) i vatten och späd till 1 liter.

3.18	Natriumhydroxidlösning, c = 1 mol/l: Lös 40 g NaOH (punkt 3.5) i vatten och späd till 1 liter.

3.19	Myrsyra-fenollösning: Blanda 889 g myrsyra (punkt 3.2) med 111 g vatten och tillsätt 4,73 g fenol (punkt 3.3).

3.20	Hydrolysblandning, c = 6 mol HCl/l innehållande 1 g fenol/l: Tillsätt 1 g fenol (punkt 3.3) till 492 ml HCl (punkt 3.7) och späd med vatten till 1 liter.

3.21	Extraktionsblandning, c = 0,1 mol HCl/l innehållande 2 % tiodiglykol: ta 8,2 ml HCl (punkt 3.7) och späd med ca 900 ml vatten. Tillsätt 20 ml tiodiglykol (punkt 3.9) och späd med vatten till 1 liter (blanda inte ämnena i punkterna 3.7 och 3.9 direkt).

3.22	5-Sulfosalicylsyra, ß = 6 %: Lös 60 g 5-sulfosalicylsyra (punkt 3.6) i vatten och späd till 1 liter.

3.23

Oxidationsblandning (permyrsyra-fenol): Blanda 0,5 ml väteperoxid (punkt 3.1) med 4,5 ml myrsyra-fenollösning (punkt 3.19) i en liten bägare. Inkubera i 20–30 °C i en timme för att permyrsyra ska bildas, kyl sedan i isvattenbad (15 min.) före tillsats till provet. Varning: undvik hudkontakt, använd skyddskläder.

3.24	Citratbuffert, c = 0,2 mol Na+/l, pH 2,20: Lös 19,61 g natriumcitrat (punkt 3.8), 5 ml tiodiglykol (punkt 3.9), 1 g fenol (punkt 3.3) och 16,50 ml HCl (punkt 3.7) i ca 800 ml vatten. Justera pH till 2,20. Späd med vatten till 1 liter.

3.25	Elueringsbuffertar som lämpar sig för den analysator som används (punkt 4.9).

3.26	Ninhydrinreagens som lämpar sig för den analysator som används (punkt 4.9).

3.27	Standardlösningar av aminosyror. Dessa lösningar ska förvaras vid en temperatur under 5 °C.

3.27.1

Stamlösningar av aminosyror (punkt 3.16.1), c = 2,5 μmol/ml av var och en i saltsyra. Finns att köpa i handeln.

3.27.2

Stamlösning av cysteinsyra och metioninsulfon, c = 1,25 μmol/ml: Lös 0,2115 g cysteinsyra (punkt 3.16.2) och 0,2265 g metioninsulfon (punkt 3.16.3) i citratbuffert (punkt 3.24) i en 1 liter mätkolv och späd till märket med citratbuffert. Kan förvaras vid en temperatur under 5 °C i högst 12 månader. Denna lösning används ej om stamlösningen (punkt 3.27.1) innehåller cysteinsyra och metioninsulfon.

3.27.3

Stamlösning av intern standard, t.ex. norleucin, c = 20 μmol/ml: Lös 0,6560 g norleucin (punkt 3.13) i citratbuffert (punkt 3.24) i en mätkolv och späd till 250 ml med citratbuffert. Kan förvaras vid en temperatur under 5 °C i högst 6 månader.

3.27.4

Kalibreringslösning av standardaminosyror för användning med hydrolysater, c = 5 nmol/50 μl för cysteinsyra och metioninsulfon och c = 10 nmol/50 μl för övriga aminosyror: lös 2,2 g natriumklorid (punkt 3.10) i en 100 ml bägare med 30 ml citratbuffert (punkt 3.24). Tillsätt 4,00 ml stamlösning av aminosyror (punkt 3.27.1), 4,00 ml stamlösning av cysteinsyra och metioninsulfon (punkt 3.27.2) och 0,50 ml stamlösning av intern standard (punkt 3.27.3) om sådan används. Justera pH till 2,20 med natriumhydroxid (punkt 3.18). Överför kvantitativt till en 50 ml mätkolv, späd till märket med citratbuffert (punkt 3.24) och blanda. Kan förvaras vid en temperatur under 5 °C i högst 3 månader. Se även punkt 9.1.

3.27.5

Kalibreringslösning av standardaminosyror för användning med hydrolysater beredda enligt punkt 5.3.3.1 och för användning med extrakt (punkt 5.2). Kalibreringslösningen bereds enligt punkt 3.27.4 men utan natriumklorid. Kan förvaras vid en temperatur under 5 °C i högst 3 månader.

4.   Utrustning

4.1	100 eller 250 ml rundkolv med återloppskylare.

4.2	100 ml borosilikatglasflaska med skruvkork försedd med gummi/teflontätning (t.ex. Duran, Schott) för användning i ugn.

4.3	Ugn med fläktventilation och temperaturreglering med noggrannhet bättre än ± 2 °C.

4.4	pH-meter (tre decimalers noggrannhet).

4.5	Membranfilter (0,22 μm).

4.6	Centrifug.

4.7	Rotationsindunstare.

4.8	Mekanisk skakapparat eller magnetomrörare.

4.9

Aminosyraanlysator eller HPLC-utrustning med jonbytarkolonn, anordning för ninhydrin, post-kolonnderivatisering och fotometrisk detektor. Kolonnen fylls med sulfonerad polystyren som kan separera aminosyrorna från varandra och från andra ninhydrinpositiva material. Flödet av buffert och ninhydrin ombesörjs av pumpar vars flödesstabilitet är ± 0,5 % under både standardkalibreringen och analysen av provet. Med vissa aminosyraanalysatorer kan man använda hydrolysmetoder där hydrolysatet har en natriumkoncentration på c = 0,8 mol/l och innehåller allt överskott av myrsyra från oxidationssteget. Andra ger inte en tillfredsställande separation av vissa aminosyror i hydrolysat vid ett överskott av myrsyra och/eller hög natriumkoncentration. I detta fall reduceras syravolymen genom indunstning till ca 5 ml efter hydrolysen och före pH-justeringen. Indunstningen ska utföras i vakuum vid högst 40 °C.

5.   Förfarande

5.1   Provberedning

Provet mals så att det kan passera genom en 0,5 mm sikt. Prover med hög vattenhalt ska antingen lufttorkas vid en temperatur på högst 50 °C eller frystorkas före malning. Prover med hög fetthalt ska extraheras med petroleumeter (punkt 3.12) före malning.

5.2   Bestämning av fria aminosyror

Väg med en noggrannhet av 0,2 mg upp en lämplig mängd (1–5 g) av det beredda provet (5.1) i en E-kolv och tillsätt 100,0 ml av extraktionsblandningen (punkt 3.21). Blanda i 60 minuter med en mekanisk skakapparat eller magnetomrörare (punkt 4.8). Låt sedimentera och pipettera 10,0 ml av supernatanten till en 100 ml bägare.

Tillsätt 5,0 ml sulfosalicylsyralösning (punkt 3.22) under omrörning och fortsätt röra om med hjälp av en magnetomrörare i fem minuter. Filtrera eller centrifugera supernatanten för att avlägsna eventuella fällningar. Överför 10,0 ml av den kvarvarande lösningen till en 100 ml bägare och justera pH till 2,20 med natriumhydroxidlösning (punkt 3.18), överför till en mätkolv av lämplig volym med citratbuffert (punkt 3.24) och späd till märket med buffertlösningen (punkt 3.24).

Om en intern standard används, tillsätt 1,00 ml av denna (punkt 3.27.3) för varje 100 ml färdig lösning och späd till märket med buffertlösningen (punkt 3.24).

Fortsätt med kromatografisteget enligt punkt 5.4.

Om extrakten inte analyseras samma dag ska de förvaras vid en temperatur under 5 °C.

5.3   Bestämning av totalhalt aminosyror

5.3.1   Oxidation

Väg med en noggrannhet av 0,2 mg upp 0,1–1 g av det beredda provet (punkt 5.1) i

—	en 100 ml rundkolv (punkt 4.1) för öppen hydrolys (punkt 5.3.2.3) eller,

—	en 250 ml rundkolv (punkt 4.1) om en låg natriumkoncentration är nödvändig (punkt 5.3.3.1) eller,

—	en 100 ml flaska med skruvkork (punkt 4.2) för sluten hydrolys (punkt 5.3.2.4).

Det invägda provet ska innehålla ca 10 mg kväve, och vattenhalten får inte överskrida 100 mg.

Ställ kolven/flaskan i ett isvattenbad och kyl till 0 °C, tillsätt 5 ml oxidationsblandning (punkt 3.23) och blanda med hjälp av en glasspatel med böjd spets. Tillslut kolven/flaskan innehållande spateln med en lufttät folie, ställ isvattenbadet innehållande den tillslutna behållaren i ett kylskåp vid 0 °C och låt stå i 16 timmar. Avlägsna provet ur kylskåpet efter 16 timmar och avlägsna överskottet av oxidationsreagens genom tillsats av 0,84 g natriumdisulfit (punkt 3.4).

Fortsätt till punkt 5.3.2.1.

5.3.2   Hydrolys

5.3.2.1

Hydrolys av oxiderade prover Tillsätt 25 ml av hydrolysblandningen (punkt 3.20) till det oxiderade prov som beretts enligt punkt 5.3.1. Skölj ned eventuella provrester som fastnat på kärlets sidor och på spateln. Fortsätt enligt punkt 5.3.2.3 eller 5.3.2.4, beroende på vilken hydrolysmetod som används.

5.3.2.2

Hydrolys av ooxiderade prover Väg med en noggrannhet av 0,2 mg upp 0,1–1 g av det beredda provet (punkt 5.1) i antingen en 100 ml eller 250 ml rundkolv (punkt 4.1) eller en 100 ml flaska med skruvkork (punkt 4.2). Det invägda provet ska innehålla ca 10 mg kväve. Tillsätt försiktigt 25 ml av hydrolysblandningen (punkt 3.20) och blanda med provet. Fortsätt enligt punkt 5.3.2.3 eller 5.3.2.4.

5.3.2.3

Öppen hydrolys Tillsätt tre glaspärlor till blandningen i kolven (beredd enligt punkt 5.3.2.1 eller 5.3.2.2) och återloppskoka i 23 timmar. Efter fullbordad hydrolys, skölj kylaren med 5 ml citratbuffert (punkt 3.24). Koppla bort kolven och kyl den i ett isvattenbad. Fortsätt enligt punkt 5.3.3.

5.3.2.4

Sluten hydrolys Sätt in flaskan med blandningen, beredd enligt punkt 5.3.2.1 eller 5.3.2.2, i en ugn (punkt 4.3) vid 110 °C. För att förhindra tryckökning (på grund av gasutveckling) och explosion bör skruvkorken sättas löst på flaskan under den första timmen. Tillslut inte flaskan med skruvkorken. Efter en timme dras skruvkorken åt och flaskan får stå i ugnen (punkt 4.3) i 23 timmar. Efter fullbordad hydrolys, ta ut flaskan ur ugnen, öppna försiktigt skruvkorken och ställ flaskan i ett isvattenbad. Låt svalna. Beroende på metod för pH-justering (punkt 5.3.3), överför flaskans innehåll kvantitativt till en 250 ml bägare eller en 250 ml rundkolv med citratbuffert (punkt 3.24). Fortsätt enligt punkt 5.3.3.

5.3.3   Justering av pH

Beroende på aminosyraanalysatorns (punkt 4.9) natriumtolerans, fortsätt enligt punkt 5.3.3.1 eller 5.3.3.2 för pH-justeringen.

5.3.3.1

Kromatografiska system (punkt 4.9) som kräver en låg natriumkoncentration Det är lämpligt att använda en stamlösning av intern standard (punkt 3.27.3) om aminosyraanalysatorn kräver en låg natriumkoncentration (och om syravolymen måste reduceras). Tillsätt i detta fall 2,00 ml stamlösning av intern standard (punkt 3.27.3) till hydrolysatet före indunstningen. Tillsätt 2 droppar 1-oktanol (punkt 3.15) till det hydrolysat som erhållits enligt punkt 5.3.2.3 eller 5.3.2.4. Låt provet indunsta i rotationsindunstare (punkt 4.7) till 5–10 ml i vakuum vid 40 °C. Om volymen av någon anledning reduceras till mindre än 5 ml ska hydrolysatet kastas och analysen göras om. Justera pH till 2,20 med natriumhydroxidlösning (punkt 3.18) och fortsätt enligt punkt 5.3.4.

5.3.3.2

Alla övriga aminosyraanalysatorer (punkt 4.9) Ta det hydrolysat som erhölls enligt punkt 5.3.2.3 eller 5.3.2.4 och neutralisera det delvis genom att försiktigt och under omrörning tillsätta 17 ml natriumhydroxidlösning (punkt 3.17), och se till att temperaturen hålls under 40 °C. Justera pH till 2,20 vid rumstemperatur med natriumhydroxidlösning i punkt 3.17 och sedan med den i punkt 3.18. Fortsätt enligt punkt 5.3.4.

5.3.4   Provlösning för kromatografi

Överför kvantitativt det pH-justerade hydrolysatet (punkt 5.3.3.1 eller 5.3.3.2) med citratbuffert (punkt 3.24) till en 200 ml mätkolv och späd till märket med buffert (punkt 3.24).

Om en intern standard inte redan använts, tillsätt 2,00 ml av denna (punkt 3.27.3) och späd till märket med citratbuffert (punkt 3.24). Blanda noggrant.

Fortsätt med kromatografisteget enligt punkt 5.4.

Om provlösningarna inte analyseras samma dag ska de förvaras vid en temperatur under 5 °C.

5.4   Kromatografi

Före kromatografin, låt extraktet (punkt 5.2) eller hydrolysatet (punkt 5.3.4) anta rumstemperatur. Skaka blandningen och filtrera en lämplig mängd genom ett 0,22 μm membranfilter (punkt 4.5). Den klara lösning som erhålls ska genomgå jonbyteskromatografi i en aminosyraanalysator (punkt 4.9).

Injektionen kan utföras antingen manuellt eller automatiskt. Det är viktigt att samma mängd lösning ± 0,5 % tillsätts kolonnen för analys av standarder och prover, utom när en intern standard används, och att kvoten natrium/aminosyra i standard- och provlösningarna är så lika som möjligt.

Hur ofta kalibreringsprover behöver köras beror i allmänhet på ninhydrinreagensens stabilitet och typen av analyssystem. Standarden eller provet späds med citratbuffert (punkt 3.24) för att ge en topparea för standarden på 30–200 % av topparean för aminosyrorna i provet.

Kromatografin av aminosyror varierar något beroende på typen av analysator och massa. Det valda systemet ska kunna separera aminosyrorna från varandra och från ninhydrinpositiva material. Kromatografisystemet ska i driftsområdet ge en linjär respons på förändringar i de aminsyramängder som tillförs kolonnen.

Under kromatografisteget gäller de botten/toppkvoter som anges nedan när en ekvimolär lösning (av de aminosyror som mäts) analyseras. Denna ekvimolära lösning ska innehålla minst 30 % av den maximala mängd av varje aminosyra som med noggrannhet kan bestämmas med analyssystemet (punkt 4.9).

För separering av treonin och serin bör botten/toppkvoten för den lägre av de två överlappande aminosyrorna på kromatogrammet inte överskrida 2:10. (Om endast cyst(e)in, metionin, treonin och lysin bestäms kommer otillräcklig separation från angränsande toppar att påverka bestämningen). För alla andra aminosyror måste separationen vara bättre än 1:10.

Systemet ska kunna separera lysin från ’lysinartefakter’ och ornitin.

6.   Beräkning av resultat

Arean för provets och standardens toppar mäts för varje enskild aminosyra, och mängden (X) i gram aminosyra per kg prov beräknas.

Om intern standard används, multiplicera med

A	=	topparea, hydrolysat eller extrakt,
B	=	topparea, kalibreringslösning,
C	=	topparea, intern standard i hydrolysat eller extrakt,
D	=	topparea, intern standard, kalibreringslösning,
M	=	molvikt för den aminosyra som bestäms,
c	=	standardlösningens koncentration i μmol/ml,
m	=	provets vikt i gram (korrigerad till ursprungsvikten om provet torkats eller avfettats),
V	=	ml totalt hydrolysat (punkt 5.3.4) eller ml beräknad total spädningsvolym för extraktet (punkt 6.1).

Cystin och cystein bestäms båda som cysteinsyra i hydrolysat av oxiderat prov, men beräknas som cystin (C6H12N2O4S2, molvikt 240,30 g/mol) med hjälp av molvikten 120,15 g/mol (= 0,5 × 240,30 g/mol).

Metionin bestäms som metioninsulfon i hydrolysat av oxiderat prov, men beräknas som metionin med hjälp av molvikten för metionin: 149,21 g/mol.

Tillsatt fritt metionin bestäms efter extraktion som metionin, för beräkningen används samma molvikt.

6.1	Den totala spädningsvolymen för extrakten (F) för bestämning av fria aminosyror (punkt 5.2) beräknas enligt följande: V = det slutliga extraktets volym.

7.   Utvärdering av metoden

Metoden testades i en internationell kollaborativ avprövning 1990 med fyra olika fodertyper (blandat grisfoder, foderblandning för slaktkycklingar, proteinkoncentrat, förblandning).

Anm.:

Metoden testades i en andra internationell kollaborativ avprövning 2003 med hjälp av dubbelblindprover av start- och slutfoder för slaktkycklingar samt prover av majs, fiskmjöl och fjäderfämjöl. Mer information finns i EN ISO 13903.

Resultaten av den kollaborativa avprövningen 1990, efter eliminering av extremvärden, i form av medelvärden och standardavvikelser redovisas i nedanstående tabeller.

Medelvärden i g/kg

Referensmaterial	Aminosyra
	Treonin	Cyst(e)in	Metionin	Lysin
Blandat grisfoder	6,94 n = 15	3,01 n = 17	3,27 n = 17	9,55 n = 13
Foderblandning för slaktkycklingar	9,31 n = 16	3,92 n = 18	5,08 n = 18	13,93 n = 16
Proteinkoncentrat	22,32 n = 16	5,06 n = 17	12,01 n = 17	47,74 n = 15
Förblandning	58,42 n = 16	—	90,21 n = 16	98,03 n = 16
n = Antal deltagande laboratorier.

7.1   Repeterbarhet

Repeterbarheten uttryckt som standardavvikelse inom laboratoriet för den kollaborativa avprövningen i föregående tabell redovisas i nedanstående tabell.

Variationskoefficient (%) för repeterbarhet (CVr)

Referensmaterial	Aminosyra
	Treonin	Cyst(e)in	Metionin	Lysin
Blandat grisfoder	1,9 n = 15	3,3 n = 17	3,4 n = 17	2,8 n = 13
Foderblandning för slaktkycklingar	2,1 n = 16	2,8 n = 18	3,1 n = 18	2,1 n = 16
Proteinkoncentrat	2,7 n = 16	2,6 n = 17	2,2 n = 17	2,4 n = 15
Förblandning	2,2 n = 16	—	2,4 n = 16	2,1 n = 16
n = Antal deltagande laboratorier.

7.2   Reproducerbarhet

Resultaten uttryckt som standardavvikelse mellan laboratorier för ovannämnda kollaborativa avprövning redovisas i nedanstående tabell.

Variationskoefficient (%) för reproducerbarhet (CVR)

Referensmaterial	Aminosyra
	Treonin	Cyst(e)in	Metionin	Lysin
Blandat grisfoder	4,1 n = 15	9,9 n = 17	7,0 n = 17	3,2 n = 13
Foderblandning för slaktkycklingar	5,2 n = 16	8,8 n = 18	10,9 n = 18	5,4 n = 16
Proteinkoncentrat	3,8 n = 16	12,3 n = 17	13,0 n = 17	3,0 n = 15
Förblandning	4,3 n = 16	—	6,9 n = 16	6,7 n = 16
n = Antal deltagande laboratorier.

8.   Användning av referensmaterial

Korrekt tillämpning av metoden ska verifieras genom analys av certifierade referensmaterial om sådana finns tillgängliga. Kalibrering med godkända kalibreringslösningar för aminosyror rekommenderas.

9.   Anmärkningar

9.1

På grund av skillnaderna mellan aminosyraanalysatorer ska de slutliga koncentrationerna för kalibreringslösningarna för standardaminosyror (se punkterna 3.27.4 och 3.27.5) och för hydrolysatet (se punkt 5.3.4) användas som riktlinje. Det intervall inom vilket utrustningen ger linjär respons ska kontrolleras för alla aminosyror. Standardlösningen späds med citratbuffert så att man får toppar i mitten av intervallet.

9.2	I de fall HPLC används för att analysera hydrolysater ska försöksbetingelserna optimeras i enlighet med tillverkarens rekommendationer.

9.3	Om denna metod tillämpas på foderblandningar eller förblandningar som innehåller mer än 1 % klorid (kraftfoder, mineralfoder eller kompletteringsfoder) kan den uppmätta halten av metionin bli för låg. För att undvika detta ska provet behandlas på särskilt sätt.

10.   Prestandakriterier

En sammanställning av resultaten (med undantag för tyrosin) från de två kollaborativa avprövningarna (från 1990 i punkt 7 ovan och från 2005 i EN/ISO 13903) ger följande kriterier för repeterbarhet och reproducerbarhet. Resultaten från dessa två kollaborativa avprövningar behöver inte vara tillämpbara för andra koncentrationsintervall och matriser än dem som anges.

10.1   Repeterbarhet

Skillnaden mellan resultaten från två bestämningar som utförs på samma prov i samma laboratorium och av samma aktör får inte överskrida

—	6 % av det högre värdet för totalhalten av aminosyrorna glycin, alanin, lysin, prolin, glutaminsyra, isoleucin och histidin,

—	8 % av det högre värdet för totalhalten av aminosyrorna treonin, fenylalanin, metionin, asparaginsyra och leucin,

—	10 % av det högre värdet för totalhalten av aminosyrorna arginin och valin,

—	12 % av det högre värdet för totalhalten av aminosyran serin,

—	15 % av det högre värdet för totalhalten av aminosyran cyst(e)in.

10.2   Reproducerbarhet

Skillnaden mellan resultaten från två bestämningar som utförs på samma prov i olika laboratorier och/eller av olika aktörer får inte överskrida

—	15 % av det högre värdet för totalhalten av aminosyrorna glycin, alanin och treonin,

—	20 % av det högre värdet för totalhalten av aminosyrorna lysin, prolin, fenylalanin, metionin och asparaginsyra,

—	22 % av det högre värdet för totalhalten av aminosyrorna glutaminsyra och leucin,

—	27 % av det högre värdet för totalhalten av aminosyran arginin,

—	32 % av det högre värdet för totalhalten av aminosyran isoleucin,

—	35 % av det högre värdet för totalhalten av aminosyrorna valin och serin,

—	40 % av det högre värdet för totalhalten av aminosyran histidin,

—	50 % av det högre värdet för totalhalten av aminosyran cyst(e)in.

F.   BESTÄMNING AV TRYPTOFAN

Följande analysmetoder ska användas för bestämning av tryptofan:

—	EN ISO 13904 (Djurfoder – Bestämning av halten tryptofan).

—	Den analysmetod som beskrivs i punkterna 1–9 nedan.

1.   Syfte och tillämpningsområde

Med denna metod kan totalhalten tryptofan och halten fritt tryptofan bestämmas i foder. Ingen åtskillnad görs mellan D- och L-formerna.

2.   Princip

För bestämning av totalhalten tryptofan hydrolyseras provet i alkalisk miljö med mättad bariumhydroxidlösning och upphettas till 110 °C i 20 timmar. Efter hydrolysen tillsätts en intern standard.

För bestämning av halten fritt tryptofan extraheras provet i lätt sur miljö i närvaro av den interna standarden.

Halten av tryptofan och intern standard i hydrolysatet eller extraktet bestäms med HPLC med fluorescensdetektion.

3.   Reagens

3.1	Dubbeldestillerat vatten eller vatten av likvärdig kvalitet ska användas (konduktivitet < 10 μS/cm).

3.2	Referenssubstans: tryptofan (renhet/halt ≥ 99 %) torkat i vakuum över fosforpentoxid.

3.3	Intern standard: α-metyltryptofan (renhet/halt ≥ 99 %) torkat i vakuum över fosforpentoxid.

3.4	Bariumhydroxidoktahydrat (undvik att exponera Ba(OH)2·8H2O för större mängder luft, eftersom det då kan bildas BaCO3 som stör bestämningen) (se punkt 9.3).

3.5	Natriumhydroxid.

3.6	Ortofosforsyra, w = 85 % (w/w).

3.7	Saltsyra, ρ20 = 1,19 g/ml.

3.8	Metanol, HPLC-kvalitet.

3.9	Petroleumeter, kokpunktsintervall 40–60 °C.

3.10	Natriumhydroxidlösning, c = 1 mol/l: Lös 40,0 g NaOH (punkt 3.5) i vatten och späd till 1 liter (punkt 3.1).

3.11	Saltsyra, c = 6 mol/l: Späd 492 ml HCl (punkt 3.7) med vatten och späd till 1 liter.

3.12	Saltsyra, c = 1 mol/l: Späd 82 ml HCl (punkt 3.7) med vatten och späd till 1 liter.

3.13	Saltsyra, c = 0,1 mol/l: Späd 8,2 ml HCl (punkt 3.7) med vatten och späd till 1 liter.

3.14	Ortofosforsyra, c = 0,5 mol/l: Späd 34 ml ortofosforsyra (punkt 3.6) med vatten (punkt 3.1) och späd till 1 liter.

3.15	Koncentrerad tryptofanlösning (punkt 3.2), c = 2,50 μmol/ml: Lös 0,2553 g tryptofan (punkt 3.2) i saltsyra (punkt 3.13) i en 500 ml mätkolv och späd till märket med saltsyra (punkt 3.13). Lösningen kan förvaras vid –18 °C i högst 4 veckor.

3.16	Koncentrerad lösning av intern standard, c = 2,50 μmol/ml: Lös 0,2728 g α-metyltryptofan (punkt 3.3) i saltsyra (punkt 3.13) i en 500 ml mätkolv och späd till märket med saltsyra (punkt 3.13). Lösningen kan förvaras vid –18 °C i högst 4 veckor.

3.17

Kalibreringslösning av tryptofan och intern standard: Ta 2,00 ml koncentrerad tryptofanlösning (punkt 3.15) och 2,00 ml koncentrerad lösning av intern standard (α-metyltryptofan) (punkt 3.16). Späd med vatten (punkt 3.1) och metanol (punkt 3.8) till ungefär samma volym och samma metanolkoncentration (10–30 %) som det färdiga hydrolysatet. Denna lösning ska vara nyberedd. Den ska skyddas från direkt solljus under beredningen.

3.18	Ättiksyra.

3.19	1,1,1-Triklor-2-metyl-2-propanol.

3.20	Etanolamin, w > 98 % (w/w).

3.21	Lösning av 1 gram 1,1,1-triklor-2-metyl-2-propanol (punkt 3.19) i 100 ml metanol (punkt 3.8).

3.22	Mobilfas för HPLC: 3,00 g ättiksyra (punkt 3.18) + 900 ml vatten (punkt 3.1) + 50,0 ml lösning (punkt 3.21) av 1,1,1-triklor-2-metyl-2-propanol (punkt 3.19) i metanol (punkt 3.8) (1 g/100 ml). Justera pH till 5,00 med etanolamin (punkt 3.20). Späd till 1 000 ml med vatten (punkt 3.1).

4.   Utrustning

4.1	HPLC-utrustning med en spektrofluorometrisk detektor.

4.2	HPLC-kolonn, 125 × 4 mm, packad med 3 μm C18 eller motsvarande.

4.3

pH-meter.

4.4	Polypropylenflaska, 125 ml, med vid hals och skruvkork.

4.5	Membranfilter, 0,45 μm.

4.6	Autoklav, 110 (± 2) °C, 1,4 (± 0,1) bar.

4.7	Mekanisk skakapparat eller magnetomrörare.

4.8	Vortexblandare.

5.   Förfarande

5.1   Provberedning

Provet mals så att det kan passera genom en 0,5 mm sikt. Prover med hög vattenhalt ska antingen lufttorkas vid en temperatur på högst 50 °C eller frystorkas före malning. Prover med hög fetthalt ska extraheras med petroleumeter (punkt 3.9) före malning.

5.2   Bestämning av fritt tryptofan (extrakt)

Väg med en noggrannhet av 1 mg upp en lämplig mängd (1–5 g) av det beredda provet (punkt 5.1) i en E-kolv. Tillsätt 100,0 ml saltsyra (punkt 3.13) och 5,00 ml koncentrerad lösning av intern standard (punkt 3.16). Skaka eller blanda i 60 minuter med en mekanisk skakapparat eller magnetomrörare (punkt 4.7). Låt sedimentera och pipettera sedan 10,0 ml av supernatanten till en bägare. Tillsätt 5 ml ortofosforsyra (punkt 3.14). Justera pH till 3 med natriumhydroxid (punkt 3.10). Tillsätt så mycket metanol (punkt 3.8) att koncentrationen blir 10–30 % i slutvolymen. Överför till en mätkolv av lämplig volym och späd med vatten till den volym som behövs för kromatografi (ungefär samma volym som kalibreringslösningen [punkt 3.17]).

Filtrera några ml av lösningen genom ett 0,45 μm membranfilter (punkt 4.5) före injektion i HPLC-kolonnen. Fortsätt med kromatografisteget enligt punkt 5.4.

Skydda standardlösning och extrakt från direkt solljus. Om extrakten inte kan analyseras samma dag kan de förvaras vid 5 °C i högst 3 dagar.

5.3   Bestämning av totalhalt tryptofan (hydrolysat)

Väg med en noggrannhet av 0,2 mg upp 0,1–1 g av det beredda provet (punkt 5.1) i en polypropylenflaska (punkt 4.4). Det invägda provet ska innehålla ca 10 mg kväve. Tillsätt 8,4 g bariumhydroxidoktahydrat (punkt 3.4) och 10 ml vatten. Blanda med en vortexblandare (punkt 4.8) eller magnetomrörare (punkt 4.7). Lämna kvar den teflontäckta magneten i blandningen. Skölj kärlets väggar med 4 ml vatten. Sätt på skruvkorken och skruva åt den löst. Sätt kärlet i en autoklav (punkt 4.6) med kokande vatten och låt ånga i 30–60 minuter. Stäng autoklaven och autoklavera vid 110 (± 2) °C i 20 timmar.

Sänk temperaturen till strax under 100 °C innan autoklaven öppnas. Tillsätt 30 ml rumstempererat vatten till den varma blandningen för att undvika kristallisering av Ba(OH)2·8H2O. Skaka eller rör försiktigt. Tillsätt 2,00 ml koncentrerad lösning av intern standard (α-metyltryptofan) (punkt 3.16). Kyl kärlet i isvattenbad i 15 minuter.

Tillsätt 5 ml ortofosforsyra (punkt 3.14). Låt kärlet vara kvar i kylbadet och neutralisera lösningen med saltsyra (punkt 3.11) under omrörning. Justera pH till 3,0 med saltsyra (punkt 3.12). Tillsätt så mycket metanol att koncentrationen blir 10–30 % i slutvolymen. Överför till en mätkolv av lämplig volym och späd med vatten till den volym som behövs för kromatografi (t.ex. 100 ml). Tillsatsen av metanol bör göras utan att någon fällning bildas.

Filtrera några ml av lösningen genom ett 0,45 μm membranfilter (punkt 4.5) före injektion i HPLC-kolonnen. Fortsätt med kromatografisteget enligt punkt 5.4.

Skydda standardlösning och hydrolysat mot direkt solljus. Om hydrolysaten inte kan analyseras samma dag kan de förvaras vid 5 °C i högst tre dagar.

5.4   HPLC-bestämning

Följande betingelser för isokratisk eluering anges som vägledning. Andra betingelser kan väljas om de ger likvärdiga resultat (se även punkterna 9.1 och 9.2).

HPLC-kolonn (punkt 4.2):	125 × 4 mm, packad med 3 μm C18 eller motsvarande
Kolonntemperatur:	Rumstemperatur
Mobilfas (punkt 3.22):	3,00 g ättiksyra (punkt 3.18) + 900 ml vatten (punkt 3.1) + 50,0 ml lösning (punkt 3.21) av 1,1,1-triklor-2-metyl-2-propanol (punkt 3.19) i metanol (punkt 3.8) (1 g/100 ml). Justera pH till 5,00 med etanolamin (punkt 3.20). Späd till 1 000 ml med vatten (punkt 3.1)
Flödeshastighet:	1 ml/min
Total körtid:	ca 34 min
Detektionsvåglängd:	excitation: 280 nm, emission: 356 nm
Injektionsvolym:	20 μl

6.   Beräkning av resultat

Mängden tryptofan (X) i gram per 100 g prov beräknas enligt följande:

A	=	topparea för intern standard, kalibreringslösning (punkt 3.17),
B	=	topparea för tryptofan, extrakt (punkt 5.2) eller hydrolysat (punkt 5.3),
V1	=	volym i ml (2 ml) av koncentrerad tryptofanlösning (punkt 3.15) som satts till kalibreringslösningen (punkt 3.17),
c	=	koncentration i μmol/ml (= 2,50) av koncentrerad tryptofanlösning (punkt 3.15) som satts till kalibreringslösningen (punkt 3.17),
V2	=	volym i ml av koncentrerad lösning av intern standard (punkt 3.16) som satts till vid extraktionen (punkt 5.2) (= 5,00 ml) eller till hydrolysatet (punkt 5.3) (= 2,00 ml),
C	=	topparea för intern standard, extrakt (punkt 5.2) eller hydrolysat (punkt 5.3),
D	=	topparea för tryptofan, kalibreringslösning (punkt 3.17),
V3	=	volym i ml (2,00 ml) av koncentrerad lösning av intern standard (punkt 3.16) som satts till kalibreringslösningen (punkt 3.17),
m	=	provets vikt i gram (korrigerad till den ursprungliga vikten om provet har torkats och/eller avfettats),
M	=	molvikt för tryptofan (= 204,23 g/mol).

7.   Repeterbarhet

Skillnaden mellan resultaten från två parallella bestämningar som utförs på samma prov får inte överskrida 10 % av det högre värdet.

8.   Resultat av en kollaborativ avprövning

I en kollaborativ avprövning inom EU (fjärde jämförelsen) analyserades tre prover av upp till tolv laboratorier för certifiering av hydrolysmetoden. Varje prov analyserades fem gånger. Resultaten redovisas i nedanstående tabell.

	Prov 1 Grisfoder	Prov 2 Grisfoder med tillsats av L-tryptofan	Prov 3 Kraftfoder för grisar
L	12	12	12
n Medelvärde [g/kg]	50 2,42	55 3,40	50 4,22
sr [g/kg]	0,05	0,05	0,08
r [g/kg]	0,14	0,14	0,22
CVr [%]	1,9	1,6	1,9
SR [g/kg]	0,15	0,20	0,09
R [g/kg]	0,42	0,56	0,25
CVR [%]	6,3	6,0	2,2
L = antal laboratorier som lämnade in resultat, n = antalet återstående enskilda resultat efter eliminering av extremvärden (enligt Cochran-Dixons extremvärdestest), sr = standardavvikelse för repeterbarhet, SR = standardavvikelse för reproducerbarhet. r = repeterbarhet, R = reproducerbarhet, CVr = variationskoefficient för repeterbarhet, %, CVR = variationskoefficient för reproducerbarhet, %.

I en annan kollaborativ avprövning inom EU (tredje jämförelsen) analyserades två prover av upp till tretton laboratorier för certifiering av extraktionsmetoden för fritt tryptofan. Varje prov analyserades fem gånger. Resultaten redovisas i nedanstående tabell.

	Prov 4 Vete- och sojablandning	Prov 5 Vete- och sojablandning (= prov 4) med tillsats av tryptofan (0,457 g/kg)
L n	12 55	12 60
Medelvärde [g/kg]	0,391	0,931
sr [g/kg]	0,005	0,012
r [g/kg]	0,014	0,034
CVr [%]	1,34	1,34
SR [g/kg]	0,018	0,048
R [g/kg]	0,050	0,134
CVR [%]	4,71	5,11
L = antal laboratorier som lämnade in resultat, n = antalet återstående enskilda resultat efter eliminering av extremvärden (enligt Cochran-Dixons extremvärdestest), sr = standardavvikelse för repeterbarhet, SR = standardavvikelse för reproducerbarhet. r = repeterbarhet, R = reproducerbarhet, CVr = variationskoefficient för repeterbarhet, %, CVR = variationskoefficient för reproducerbarhet, %.

I ytterligare en kollaborativ avprövning inom EU analyserades fyra prover av upp till sju laboratorier för certifiering av metoden för tryptofanhydrolys. Resultatet redovisas i nedanstående tabell. Varje prov analyserades fem gånger.

	Prov 1 Blandat grisfoder (CRM 117)	Prov 2 Fiskmjöl med låg fetthalt (CRM 118)	Prov 3 Sojamjöl (CRM 119)	Prov 4 Skummjölkspulver (CRM 120)
L	7	7	7	7
n	25	30	30	30
Medelvärde [g/kg]	2,064	8,801	6,882	5,236
sr [g/kg]	0,021	0,101	0,089	0,040
r [g/kg]	0,059	0,283	0,249	0,112
CVr [%]	1,04	1,15	1,30	0,76
SR [g/kg]	0,031	0,413	0,283	0,221
R [g/kg]	0,087	1,156	0,792	0,619
CVR [%]	1,48	4,69	4,11	4,22
L = antal laboratorier som lämnade in resultat, n = antalet återstående enskilda resultat efter eliminering av extremvärden (enligt Cochran-Dixons extremvärdestest), sr = standardavvikelse för repeterbarhet, SR = standardavvikelse för reproducerbarhet, r = repeterbarhet, R = reproducerbarhet, CVr = variationskoefficient för repeterbarhet, %, CVR = variationskoefficient för reproducerbarhet, %.

9.   Anmärkningar

9.1

För att få bättre separation mellan tryptofan och α-metyltryptofan kan man prova att använda följande kromatografiska betingelser: Isokratisk eluering följt av rening av kolonnen med hjälp av en gradient:HPLC-kolonn: 125 × 4 mm, packad med 5 μm C18 eller motsvarande Kolonntemperatur: 32 °C Mobilfas: A: 0,01 mol/l KH2PO4/metanol, 95 + 5 (v+v) B: metanol Gradientprogram: 0 min 100 % A 0 % B 15 min 100 % A 0 % B 17 min 60 % A 40 % B 19 min 60 % A 40 % B 21 min 100 % A 0 % B 33 min 100 % A 0 % B Flödeshastighet: 1,2 ml/min Total körtid: ca 33 min

9.2

Kromatografin varierar beroende på typen av HPLC och vilket material som kolonnen packats med. Det valda systemet ska klara av att ge baslinjeseparation mellan tryptofan och intern standard. Det är också viktigt att nedbrytningsprodukter tydligt kan separeras från tryptofan och intern standard. Man bör köra hydrolysat utan intern standard för att upptäcka eventuella orenheter på baslinjen under den interna standarden. Det är viktigt att körtiden är så lång att alla nedbrytningsprodukter hinner elueras ut, annars kan sena elueringstoppar störa efterföljande körningar. Kromatografisystemet ska ge linjär respons i driftsområdet. Den linjära responsen ska mätas med en konstant koncentration (den normala) av intern standard och varierande koncentrationer av tryptofan. Det är viktigt att topparna för både tryptofan och intern standard ligger inom det linjära intervallet för HPLC-/fluorescenssystemet. Om topparna för tryptofan och/eller intern standard är för låga eller för höga bör bestämningen göras om med annan provstorlek och/eller slutvolym.

9.3   Bariumhydroxid

Bariumhydroxid blir mer svårlösligt när det åldras. Detta ger en grumlig lösning för HPLC-bestämning, vilket kan ge alltför låga värden för tryptofan.

G.   BESTÄMNING AV RÅOLJA OCH RÅFETT

1.   Syfte och tillämpningsområde

Med denna metod bestäms halten råolja och råfett i foder.

Beroende på fodrets egenskaper och sammansättning samt bestämningens syfte används en av nedanstående två metoder.

För bestämning av råolja och råfett i oljeväxtfrön och oljehaltiga frukter samt i foder där halten råolja och råfett är högre än 15 % bör extraktion göras enligt metod A och upprepad extraktion enligt metod B (punkt 5.3).

1.1   Metod A – direkt extraherbar råolja och råfett

Denna metod är tillämplig på foderråvaror av vegetabiliskt ursprung, utom dem som omfattas av metod B.

1.2   Metod B – total halt råolja och råfett

Denna metod är tillämplig på foderråvaror av animaliskt ursprung och på alla foderblandningar. Den ska användas för alla råvaror från vilka olja och fett inte kan extraheras fullständigt utan föregående hydrolys, till exempel gluten, jäst, potatisprotein och produkter som genomgår processer såsom extrudering, bearbetning till flingor samt uppvärmning.

1.3   Tolkning av resultaten

I samtliga fall där ett högre resultat fås genom metod B än metod A, ska resultatet av metod B räknas som det sanna värdet.

2.   Princip

2.1   Metod A

Provet extraheras med petroleumeter. Lösningsmedlet destilleras bort och återstoden torkas och vägs.

2.2   Metod B

Provet behandlas under uppvärmning med saltsyra. Blandningen kyls och filtreras. Återstoden sköljs och torkas och bestäms enligt metod A.

3.   Reagens

3.1	Petroleumeter, kokpunktsintervall 40–60 °C. Bromtalet måste vara mindre än 1 och återstoden efter förångning mindre än 2 mg/100 ml.

3.2	Vattenfritt natriumsulfat.

3.3	Saltsyra, c = 3 mol/l.

3.4	Filtreringshjälpmedel, till exempel kiselgur, Hyflo-supercel.

4.   Utrustning

4.1	Extraktionsapparat. Om denna är försedd med hävert (Soxhletapparat), ska förångningstakten vara sådan att ca tio kretslopp sker per timme. Om hävert saknas ska förångningstakten vara ca 10 ml per minut.

4.2	Extraktionshylsorna ska vara fria från ämnen som är lösliga i petroleumeter och ha en porositet som överensstämmer med kraven i punkt 4.1.

4.3	Torkugn, antingen en vakuumtorkugn inställd på 75 (± 3) °C eller en varmluftsugn inställd på 100 (± 3) °C.

5.   Förfarande

5.1   Metod A (se punkt 8.1)

Väg med en noggrannhet av 1 mg upp 5 gram av provet, överför det till en extraktionshylsa (punkt 4.2) och täck med en fettfri bomullstuss.

Placera hylsan i en extraktionsapparat (punkt 4.1) och extrahera i sex timmar med petroleumeter (punkt 3.1). Samla upp petroleumeterextraktet i en torr, vägd kolv med pimpstensskärvor (6).

Destillera bort lösningsmedlet. Torka återstoden i 1,5 timmar i torkugnen (punkt 4.3). Kyl i en exsickator och väg. Torka igen i 30 minuter för att säkerställa att oljans och fettets vikt är konstant (viktförlusten mellan två på varandra följande vägningar får inte överskrida 1 mg).

5.2   Metod B

Väg med en noggrannhet av 1 mg upp 2,5 gram av provet (se punkt 8.2) i en 400 ml bägare eller en 300 ml E-kolv. Tillsätt 100 ml saltsyra (punkt 3.3) och pimpstensskärvor. Täck över bägaren med ett urglas eller koppla E-kolven till en återloppskylare. Låt blandningen koka sakta i en timme över en svag låga eller på en värmeplatta. Låt inte produkten fastna på behållarens insida.

Kyl och tillsätt så mycket filtreringshjälpmedel (punkt 3.4) att ingen olja och inget fett förloras under filtreringen. Filtrera genom ett fuktat, fettfritt, dubbelt filtrerpapper. Skölj återstoden i kallt vatten tills ett neutralt filtrat erhålls. Kontrollera att filtratet inte innehåller någon olja eller något fett. Om så ändå är fallet ska provet extraheras med petroleumeter, enligt metod A, före hydrolys.

Lägg det dubbla filtrerpappret med återstoden på ett urglas och torka i 1,5 timmar i varmluftsugnen (punkt 4.3) vid 100 (± 3) °C.

Placera det dubbla filtrerpappret med den torra återstoden i en extraktionshylsa (punkt 4.2) och täck med en fettfri bomullstuss. Placera hylsan i en extraktionsapparat (punkt 4.1) och fortsätt enligt punkt 5.1 andra och tredje styckena.

5.3   Metod A och upprepad extraktion enligt metod B

För bestämning av råolja och råfett i oljeväxtfrön och oljehaltiga frukter samt i foder där halten råolja och råfett är högre än 15 % bör extraktion göras enligt metod A och upprepad extraktion enligt metod B.

Detta innebär att återstoden eller en del av återstoden efter extraktion med petroleumeter (metod A) extraheras på nytt med saltsyra (metod B). Halten råolja och råfett är summan av resultatet av metod A och B.

6.   Redovisning av resultat

Återstodens vikt uttrycks i procent av provet.

7.   Repeterbarhet

Skillnaden mellan resultaten från två parallella bestämningar som utförs på samma prov av samma person får inte överskrida

—	0,2 % (absolut värde) för halter av råolja och råfett under 5 %,

—	4,0 % av det högre värdet för halter på 5–10 %,

—	0,4 % (absolut värde) för halter över 10 %.

8.   Anmärkningar

8.1

För produkter med hög olja- och fetthalt, som är svåra att krossa eller från vilka det är svårt att få fram ett homogent reducerat prov, används följande förfarande. Väg med en noggrannhet av 1 mg upp 20 gram av provet och blanda med minst 10 gram vattenfritt natriumsulfat (punkt 3.2). Extrahera med petroleumeter (punkt 3.1) enligt punkt 5.1. Späd extraktet med petroleumeter (punkt 3.1) till 500 ml och blanda. Överför 50 ml av lösningen till en liten, torr, vägd kolv som innehåller pimpstensskärvor. Destillera bort lösningsmedlet, torka och fortsätt enligt punkt 5.1 sista stycket. Avlägsna lösningsmedlet från extraktionsåterstoden i hylsan, krossa återstoden till 1 mm partikelstorlek, återför den till extraktionshylsan (tillsätt inte natriumsulfat) och fortsätt enligt punkt 5.1 andra och tredje styckena. Provets olje- och fetthalt i procent beräknas med formeln där m1 = återstodens vikt i gram efter första extraktionen (alikvoten av extraktet), m2 = återstodens vikt i gram efter andra extraktionen.

8.2	För vissa produkter (t.ex. med låg olje- och fetthalt) kan provmängden ökas.

8.3	Sällskapsdjursfoder med hög vattenhalt kan behöva blandas med vattenfritt natriumsulfat före hydrolys och extraktion enligt metod B.

8.4	I punkt 5.2 kan det vara effektivare att använda varmt vatten i stället för kallt vatten för att skölja återstoden efter filtrering.

8.5	Torktiden på 1,5 timmar kan behöva förlängas för vissa foder. För lång torktid bör undvikas eftersom detta kan leda till låga resultat. En mikrovågsugn kan också användas.

H.   BESTÄMNING AV VÄXTTRÅD

1.   Syfte och tillämpningsområde

Med denna metod bestäms halten i foder av fettfria organiska ämnen som är olösliga i sur och basisk miljö och som vanligen betecknas växttråd.

Metoden är inte tillämplig på lignocellulosa och vegetabiliskt kol (för små partiklar).

2.   Princip

Provet, som vid behov avfettas, behandlas i tur och ordning med kokande lösningar av svavelsyra och kaliumhydroxid i bestämda koncentrationer. Återstoden separeras genom filtrering på ett sintrat glasfilter och sköljs, torkas, vägs och föraskas vid en temperatur på 475–500 °C. Viktförlusten efter föraskning motsvarar andelen växttråd i provet.

3.   Reagens

3.1	Svavelsyra, c = 0,13 mol/l.

3.2	Skumdämpningsmedel (t.ex. n-oktanol).

3.3	Filtreringshjälpmedel (Celite 545 eller motsvarande), upphettat till 500 °C i fyra timmar (punkt 8.6).

3.4

Aceton.

3.5	Petroleumeter, kokpunktsintervall 40–60 °C.

3.6	Saltsyra, c = 0,5 mol/l.

3.7	Kaliumhydroxidlösning, c = 0,23 mol/l.

4.   Utrustning

4.1

Värmeenhet för uppslutning med svavelsyra och kaliumhydroxidlösning, försedd med en hållare för filterdegeln (punkt 4.2) och ett utloppsrör med kran för utsläpp av vätska samt anslutning för vakuum och eventuellt för tryckluft. Varje dag ska enheten innan den tas i bruk förvärmas med kokande vatten i 5 minuter.

4.2	Glasfilterdegel med insmält filterskiva av sintrat glas, porstorlek 40–90 μm. Innan degeln används första gången, värm den till 500 °C i några minuter och låt den svalna (punkt 8.6).

4.3	Cylinder på minst 270 ml med återloppskylare, lämplig för kokning.

4.4	Torkugn med termostat.

4.5	Muffelugn med termostat.

4.6	Extraktionsenhet bestående av en stödplatta för filterdegeln (punkt 4.2) och med ett utloppsrör med kran för utsläpp av vakuum och vätska.

4.7	Kopplingsringar för ihopmontering av värmeenheten (punkt 4.1), filterdegeln (punkt 4.2) och cylindern (punkt 4.3) och för anslutning av extraktionsenheten (punkt 4.6) och filterdegeln.

5.   Förfarande

Väg med en noggrannhet av 1 mg upp 1 g av det beredda provet i filterdegeln (punkt 4.2) (se punkterna 9.1, 9.2 och 9.3) och tillsätt 1 g filtreringshjälpmedel (punkt 3.3).

Montera ihop värmeenheten (punkt 4.1) och filterdegeln (punkt 4.2) och anslut sedan cylindern (punkt 4.3) till filterdegeln. Häll 150 ml kokande svavelsyra (punkt 3.1) i cylinder/degeluppställningen och tillsätt vid behov några droppar skumdämpningsmedel (punkt 3.2).

Koka upp vätskan inom 5 ± 2 minuter och låt koka kraftigt i exakt 30 minuter.

Öppna kranen till utloppsröret (punkt 4.1) och vakuumfiltrera svavelsyran genom filterdegeln. Tvätta återstoden tre gånger med 30 ml kokande vatten per gång och se till att återstoden vakuumfiltreras torr efter varje tvättning.

Stäng utloppskranen och häll 150 ml kokande kaliumhydroxidlösning (punkt 3.7) i cylinder/degeluppställningen. Tillsätt några droppar skumdämpningsmedel (punkt 3.2). Koka upp vätskan inom 5 ± 2 minuter och låt koka kraftigt i exakt 30 minuter. Filtrera och tvätta på samma sätt som vid behandlingen med svavelsyra.

Efter den sista tvättningen och torkningen kopplas degeln med innehåll loss och ansluts till extraktionsenheten (punkt 4.6). Anslut vakuum, tvätta återstoden i degeln tre gånger med 25 ml aceton (punkt 3.4) per gång och se till att återstoden vakuumfiltreras torr efter varje tvättning.

Torka degeln till konstant vikt i ugnen vid 130 °C. Låt den svalna i exsickator efter varje torkning och väg snabbt. Sätt in degeln i en muffelugn och föraska till konstant vikt (viktförlusten mellan två på varandra följande vägningar får inte överskrida 2 mg) vid 475–500 °C i minst 30 minuter.

Efter varje upphettning ska degeln först svalna i ugnen och sedan i exsickatorn innan den vägs.

Gör ett blankprov utan provet. Viktförlusten till följd av föraskningen får inte överskrida 4 mg.

6.   Beräkning av resultat

Provets växttrådhalt i procent beräknas med formeln

där

m	=	provets vikt i gram,
m0	=	viktförlust efter föraskning vid bestämningen, i gram,
m1	=	viktförlust efter föraskning för blankprovet, i gram.

7.   Repeterbarhet

Skillnaden mellan resultaten från två parallella bestämningar som utförs på samma prov får inte överskrida

—	0,6 % (absolut värde) om växttrådhalten är mindre än 10 %,

—	6 % av det högre värdet om växttrådhalten uppgår till 10 % eller mer.

8.   Reproducerbarhet

Skillnaden mellan resultaten från två bestämningar som utförs på samma prov i olika laboratorier får inte överskrida

—	1,0 % (absolut värde) om växttrådhalten är mindre än 10 %,

—	10 % av det högre värdet om växttrådhalten uppgår till 10 % eller mer.

9.   Anmärkningar

9.1

Foder som innehåller mer än 10 % råfett ska före analys avfettas med petroleumeter (punkt 3.5). Anslut filterdegeln (punkt 4.2) med innehåll till extraktionsenheten (punkt 4.6), anslut vakuum, tvätta återstoden tre gånger med 30 ml petroleumeter och se till att återstoden vakuumfiltreras torr. Anslut degeln med innehåll till värmeenheten (punkt 4.1) och fortsätt enligt punkt 5.

9.2

Foder som innehåller fetter som inte kan extraheras direkt med petroleumeter (punkt 3.5) ska avfettas enligt punkt 8.1 och därefter avfettas ännu en gång efter kokning med syra. Efter kokning med syra och därpå följande tvättning ansluts degeln med innehåll till extraktionsenheten (punkt 4.6) och tvättas tre gånger med 30 ml aceton per gång och därefter ytterligare tre gånger med 30 ml petroleumeter per gång. Vakuumfiltrera torrt och fortsätt analysen från och med kaliumhydroxidbehandlingen enligt punkt 5.

9.3

Om fodret innehåller mer än 5 % karbonat, uttryckt som kalciumkarbonat, ansluts degeln (punkt 4.2) med det uppvägda provet till värmeenheten (punkt 4.1). Tvätta provet tre gånger med 30 ml saltsyra (punkt 3.6) per gång. Låt provet stå ca en minut efter varje tillsats innan det filtreras. Tvätta en gång med 30 ml vatten och fortsätt sedan enligt punkt 5.

9.4	Om den utrustning som används utgörs av ett stativ (flera deglar anslutna till samma värmeenhet) får två enskilda bestämningar av samma analysprov inte ingå i samma provserie.

9.5	Om det efter kokningen är svårt att filtrera de sura och basiska lösningarna blåses tryckluft genom värmeenhetens utloppsrör, varefter filtreringen fullföljes.

9.6	För att förlänga glasfilterdeglarnas livslängd får temperaturen vid föraskningen inte överskrida 500 °C. Var noga med att undvika alltför hastiga temperaturförändringar vid uppvärmning och avkylning.

I.   BESTÄMNING AV SOCKERARTER

1.   Syfte och tillämpningsområde

Med denna metod bestäms halten reducerande sockerarter och totalhalten sockerarter efter invertering, uttryckt som glukos eller, om så är lämpligt, sackaros med omvandlingsfaktorn 0,95. Metoden är tillämplig på foderblandningar. För andra typer av foder finns särskilda metoder. Om så krävs ska laktos bestämmas separat och tas med i resultatberäkningen.

Denna metod ska användas för bestämning av halten sockerarter för beräkning av fodrets energivärde.

Om halten sockerarter ska bestämmas för andra ändamål får andra analysmetoder användas.

2.   Princip

Sockerarterna extraheras i utspädd etanol. Lösningen klaras med Carrez-lösning I och II. Efter det att etanolen eliminerats bestäms kvantiteterna före och efter invertering med Luff-Schoorl-metoden.

3.   Reagens

3.1	Etanol 40 % (v/v), densitet: 0,948 g/ml vid 20 °C, fenolftaleinneutral.

3.2	Carrez-lösning I: lös 21,9 g zinkacetat (Zn(CH3COO)2 2H2O) och 3 g isättika i vatten. Späd med vatten till 100 ml.

3.3	Carrez-lösning II: lös 10,6 g kaliumferrocyanid (K4Fe(CN)6 3H2O) i vatten. Späd med vatten till 100 ml.

3.4	Metylorange, lösning 0,1 % (w/v).

3.5	Saltsyra, 4 mol/l.

3.6	Saltsyra, 0,1 mol/l.

3.7	Natriumhydoxidlösning, 0,1 mol/l.

3.8

Luff-Schoorl-reagens: Häll citronsyralösningen (punkt 3.8.2) i natriumkarbonatlösningen (punkt 3.8.3) under noggrann omrörning. Tillsätt kopparsulfatlösningen (punkt 3.8.1) och späd med vatten till 1 liter. Låt stå över natten och filtrera. Kontrollera koncentrationen hos det erhållna reagenset (Cu 0,05 mol/l, Na2CO3 1 mol/l), se punkt 5.4 sista stycket. Lösningens pH ska vara ca 9,4.

3.8.1

Kopparsulfatlösning: lös 25 g järnfritt kopparsulfat (CuSO4 5H2O) i 100 ml vatten.

3.8.2

Citronsyralösning: lös 50 g citronsyra (C6H8O7•H2O) i 50 ml vatten.

3.8.3

Natriumkarbonatlösning: lös 143,8 g vattenfritt natriumkarbonat i ca 300 ml varmt vatten. Låt svalna.

3.9	Natriumtiosulfatlösning, 0,1 mol/l.

3.10	Stärkelselösning: tillsätt en blandning av 5 g löslig stärkelse och 30 ml vatten till 1 l kokande vatten. Koka i tre minuter, låt svalna och tillsätt vid behov 10 mg kvicksilverjodid som konserveringsmedel.

3.11	Svavelsyra, 3 mol/l.

3.12	Kaliumjodidlösning, 30 % (w/v).

3.13	Pimpstensgranulat som kokats i saltsyra, sköljts med vatten och torkats.

3.14	3-Metylbutan-1-ol.

4.   Utrustning

Omblandare: ca 35–40 varv per minut.

5.   Förfarande

5.1   Extraktion av provet

Väg med en noggrannhet av 1 mg upp 2,5 g av provet i en 250 ml mätkolv. Tillsätt 200 ml etanol (punkt 3.1) och blanda på skakapparaten i en timme. Tillsätt 5 ml Carrez-lösning I (punkt 3.2) och rör om i ca 30 sekunder. Tillsätt 5 ml Carrez-lösning II (punkt 3.3) och rör om i en minut. Späd med etanol (punkt 3.1) till full volym, homogenisera och filtrera. Avlägsna 200 ml av filtratet och låt indunsta till ungefär halv volym så att det mesta av etanolen elimineras. Överför återstoden efter avdunstningen kvantitativt, med varmt vatten, till en 200 ml mätkolv, kyl, späd med vatten till full volym, homogenisera och filtrera vid behov. Denna lösning används för att bestämma halten av reducerande sockerarter och, efter invertering, totalhalten sockerarter.

5.2   Bestämning av reducerande sockerarter

Avlägsna med pipett högst 25 ml av lösningen som innehåller mindre än 60 mg reducerande sockerarter uttryckt som glukos. Späd vid behov med destillerat vatten till 25 ml och bestäm halten reducerande sockerarter med Luff-Schoorl-metoden. Resultatet uttrycks som procent glukos i provet.

5.3   Bestämning av totalhalten sockerarter efter invertering

Pipettera 50 ml av lösningen till en 100 ml mätkolv. Tillsätt några droppar metylorangelösning (punkt 3.4) och därefter – försiktigt och under ständig omrörning – saltsyra (punkt 3.5) tills vätskan blir tydligt röd. Tillsätt 15 ml saltsyra (punkt 3.6), sänk ned kolven i ett kraftigt kokande vattenbad och låt stå i 30 minuter. Kyl hastigt till ca 20 °C och tillsätt 15 ml natriumhydroxidlösning (punkt 3.7). Späd med vatten till 100 ml och homogenisera. Avlägsna högst 25 ml av lösningen som innehåller mindre än 60 mg reducerande sockerarter uttryckt som glukos. Späd vid behov med destillerat vatten till 25 ml och bestäm halten reducerande sockerarter med Luff-Schoorl-metoden. Resultatet uttrycks som procent glukos i provet eller, om så är lämpligt, sackaros, genom att multiplicera med faktorn 0,95.

5.4   Titrering med Luff-Schoorl-metoden

Pipettera över 25 ml Luff-Schoorl-reagens (punkt 3.8) till en 300 ml E-kolv. Tillsätt exakt 25 ml av den klarade sockerlösningen. Tillsätt två korn pimpsten (punkt 3.13), hetta upp under omrörning för hand över medelstor öppen låga och låt vätskan koka i ca två minuter. Ställ omedelbart E-kolven på ett asbestklätt trådnät med ett hål med ca 6 cm diameter under vilket en låga brinner. Lågan ska justeras så att endast E-kolvens botten hettas upp. Anslut en återloppskylare till E-kolven. Låt koka i exakt 10 minuter. Kyl omedelbart i kallt vatten och titrera efter ca 5 minuter på följande sätt:

Tillsätt 10 ml kaliumjodidlösning (punkt 3.12) och omedelbart därefter (försiktigt, på grund av risken för kraftig skumbildning) 25 ml svavelsyra (punkt 3.11). Titrera med natriumtiosulfatlösning (punkt 3.9) tills en matt gul färg uppträder, tillsätt stärkelseindikatorn (punkt 3.10) och slutför titreringen.

Utför samma titrering på en noggrant uppmätt blandning av 25 ml Luff-Schoorl-reagens (punkt 3.8) och 25 ml vatten efter tillsats av 10 ml kaliumjodidlösning (punkt 3.12) och 25 ml svavelsyra (punkt 3.11) utan kokning.

6.   Beräkning av resultat

Fastställ med hjälp av tabellen nedan den glukosmängd i mg som motsvarar skillnaden mellan värdena av de båda titreringarna, uttryckt i ml 0,1 mol/l natriumtiosulfat. Resultatet uttrycks i procent av provet.

7.   Särskilda förfaranden

7.1

För foder som innehåller mycket melass eller som inte är särskilt homogena vägs 20 g upp och överförs med 500 ml vatten till en 1 l mätkolv. Blanda på skakapparaten i en timme. Gör lösningen klar med Carrez-lösning I (punkt 3.2) och Carrez-lösning II (punkt 3.3) enligt beskrivningen i punkt 5.1 men med fyra gånger så stor mängd av varje reagens. Späd till full volym med etanol 80 % (v/v). Homogenisera och filtrera. Eliminera etanolen enligt beskrivningen i punkt 5.1. Om det inte finns någon dextrinerad stärkelse, späd med destillerat vatten till full volym.

7.2

För melass och foderråvaror som innehåller mycket socker och som är nästan stärkelsefria (johannesbröd, torkad betsnitsel osv.), vägs 5 g upp i en 250 ml mätkolv, varefter 200 ml destillerat vatten tillsätts och lösningen blandas på skakapparaten i en timme eller mer om så behövs. Gör lösningen klar med Carrez-lösning I (punkt 3.2) och Carrez-lösning II (punkt 3.3) enligt beskrivningen i punkt 5.1. Späd med kallt vatten till full volym, homogenisera och filtrera. Bestäm totalhalten sockerarter enligt beskrivningen i punkt 5.3.

8.   Anmärkningar

8.1	För att förhindra skumbildning är det lämpligt att (oberoende av volym) tillsätta ca 1 ml 3-metylbutan-1-ol (punkt 3.14) före uppkokning med Luff-Schoorl-reagens.

8.2	Skillnaden mellan totalhalten sockerarter efter invertering, uttryckt som glukos, och halten reducerande sockerarter, uttryckt som glukos, multiplicerad med 0,95 ger sackaroshalten i procent.

8.3	För att bestämma halten reducerande sockerarter, med undantag av laktos, kan två metoder användas:

8.3.1

För en ungefärlig beräkning multipliceras den laktoshalt som fastställts med en annan analysmetod med 0,675, och subtrahera det erhållna resultatet från halten reducerande sockerarter.

8.3.2

För en exakt beräkning av reducerande sockerarter, med undantag av laktos, måste samma prov användas för de två slutliga bestämningarna. Den ena analysen utförs på en del av den lösning som erhållits enligt punkt 5.1 och den andra på en del av den lösning som erhållits vid bestämningen av laktos med den metod som fastställts för detta ändamål (efter det att de andra sockerarterna jästs och lösningen klarats). I båda fallen bestäms mängden befintliga sockerarter med Luff-Schoorl-metoden och beräknas i mg glukos. Det ena av värdena subtraheras från det andra och skillnaden uttrycks i procent av provet. Exempel De två valda volymerna motsvarar vid varje bestämning ett prov på 250 mg. I det första fallet förbrukas 17 ml 0,1 mol/l natriumtiosulfatlösning, vilket motsvarar 44,2 mg glukos, och i det andra fallet 11 ml, vilket motsvarar 27,6 mg glukos. Skillnaden är 16,6 mg glukos. Halten reducerande socker (med undantag av laktos) beräknad som glukos är alltså: Tabell över värden för 25 ml Luff-Schoorl-reagens ml 0,1 mol/l Na2S2O3, uppvärmning 2 minuter, kokning 10 minuter Na2S2O3 0,1 mol/l Glukos, fruktos, invertsocker C6H12O6 Laktos C12H22O11 Na2S2O3 0,1 mol/l ml mg skillnad mg skillnad ml 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 2,4 4,8 7,2 9,7 12,2 14,7 17,2 19,8 22,4 25,0 27,6 30,3 33,0 35,7 38,5 41,3 44,2 47,1 50,0 53,0 56,0 59,1 62,2 2,4 2,4 2,5 2,5 2,5 2,5 2,6 2,6 2,6 2,6 2,7 2,7 2,7 2,8 2,8 2,9 2,9 2,9 3,0 3,0 3,1 3,1 3,6 7,3 11,0 14,7 18,4 22,1 25,8 29,5 33,2 37,0 40,8 44,6 48,4 52,2 56,0 59,9 63,8 67,7 71,7 75,7 79,8 83,9 88,0 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,9 3,9 3,9 4,0 4,0 4,1 4,1 4,1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

J.   BESTÄMNING AV LAKTOS

1.   Syfte och tillämpningsområde

Med denna metod bestäms laktoshalten i foder som innehåller mer än 0,5 % laktos.

2.   Princip

Sockerarterna löses upp i vatten. Lösningen fermenteras med jästen Saccharomyces cerevisiae som lämnar laktosen opåverkad. Efter klarning och filtrering bestäms laktoshalten i filtratet med Luff-Schoorl-metoden.

3.   Reagens

3.1	Suspension av Saccharomyces cerevisiae: slamma upp 25 g färsk jäst i 100 ml vatten. Suspensionen håller sig högst en vecka i kylskåp.

3.2	Carrez-lösning I: lös 21,9 g zinkacetat (Zn(CH3 COO)2 2H2O) och 3 g isättika i vatten. Späd med vatten till 100 ml.

3.3	Carrez-lösning II: lös 10,6 g kaliumferrocyanid (K4Fe(CN)6 3H2O) i vatten. Späd med vatten till 100 ml.

3.4

Luff-Schoorl-reagens: Häll citronsyralösningen (punkt 3.4.2) i natriumkarbonatlösningen (punkt 3.4.3) under noggrann omrörning. Tillsätt kopparsulfatlösningen (punkt 3.4.1) och späd med vatten till 1 liter. Låt stå över natten och filtrera. Kontrollera koncentrationen hos det erhållna reagenset (Cu 0,05 mol/l, Na2CO3 1 mol/l). Lösningens pH ska vara ca 9,4.

3.4.1

Kopparsulfatlösning: lös 25 g järnfritt kopparsulfat (CuSO4 5H2O) i 100 ml vatten.

3.4.2

Citronsyralösning: lös 50 g citronsyra (C6H8O7•H2O) i 50 ml vatten.

3.4.3

Natriumkarbonatlösning: lös 143,8 g vattenfritt natriumkarbonat i ca 300 ml varmt vatten. Låt svalna.

3.5	Pimpstensgranulat som kokats i saltsyra, sköljts med vatten och torkats.

3.6	Kaliumjodidlösning, 30 % (w/v).

3.7	Svavelsyra, 3 mol/l.

3.8	Natriumtiosulfatlösning, 0,1 mol/l.

3.9	Stärkelselösning: tillsätt en blandning av 5 g löslig stärkelse och 30 ml vatten till 1 l kokande vatten. Koka i 3 minuter, låt svalna och tillsätt vid behov 10 mg kvicksilverjodid som konserveringsmedel.

4.   Utrustning

Vattenbad med termostaten inställd på 38–40 °C.

5.   Förfarande

Väg med en noggrannhet av 1 mg upp 1 g av provet i en 100 ml mätkolv. Tillsätt 25–30 ml vatten. Låt kolven stå i ett kokande vattenbad i 30 minuter och kyl sedan till ca 35 °C. Tillsätt 5 ml jästsuspension (punkt 3.1) och homogenisera. Låt kolven stå i vattenbad i två timmar vid en temperatur av 38–40 °C. Kyl därefter till ca 20 °C.

Tillsätt 2,5 ml Carrez-lösning I (punkt 3.2), rör om i 30 sekunder och tillsätt sedan 2,5 ml Carrez-lösning II (punkt 3.3) och rör om i ytterligare 30 sekunder. Späd med vatten till 100 ml, blanda och filtrera. Avlägsna med pipett högst 25 ml av filtratet som bör innehålla 40–80 mg laktos och överför detta till en 300 ml E-kolv. Späd vid behov med vatten till 25 ml.

Utför ett blankprov på samma sätt med 5 ml jästsuspension (punkt 3.1). Fastställ laktoshalten enligt Luff-Schoorl på följande sätt: tillsätt exakt 25 ml Luff-Schoorl-reagens (punkt 3.4) och två korn pimpsten (punkt 3.5). Hetta upp under omrörning för hand över medelstor öppen låga och låt vätskan koka i ca två minuter. Ställ omedelbart E-kolven på ett asbestklätt trådnät med ett hål med ca 6 cm diameter under vilket en låga brinner. Lågan ska justeras så att endast E-kolvens botten hettas upp. Anslut en återloppskylare till E-kolven. Låt koka i exakt 10 minuter. Kyl omedelbart i kallt vatten och titrera efter ca 5 minuter på följande sätt:

Tillsätt 10 ml kaliumjodidlösning (punkt 3.6) och omedelbart därefter (försiktigt, på grund av risken för kraftig skumbildning) 25 ml svavelsyra (punkt 3.7). Titrera med natriumtiosulfatlösning (punkt 3.8) tills en matt gul färg uppträder, tillsätt stärkelseindikatorn (punkt 3.9) och slutför titreringen.

Utför samma titrering på en noggrant uppmätt blandning av 25 ml Luff-Schoorl-reagens (punkt 3.4) och 25 ml vatten efter tillsats av 10 ml kaliumjodidlösning (punkt 3.6) och 25 ml svavelsyra (punkt 3.7) utan kokning.

6.   Beräkning av resultat

Fastställ med hjälp av tabellen nedan den laktosmängd i mg som motsvarar skillnaden mellan resultaten av de båda titreringarna, uttryckt i ml 0,1 mol/l natriumtiosulfat.

Uttryck resultatet som halten vattenfri laktos i procent av provet.

7.   Anmärkning

1.	För produkter som innehåller mer än 40 % jäsbara sockerarter används mer än 5 ml jästsuspension (punkt 3.1).

2.

I laktosreducerat foder (t.ex. kattmjölk) omvandlas laktos till fruktos, som inte jäses fullständigt inom två timmar, vilket leder till högre eller falska positiva resultat (eftersom det finns kvar rester av fruktos i extraktet). Tabell över värden för 25 ml Luff-Schoorl-reagens ml 0,1 mol/l Na2S2O3, uppvärmning 2 minuter, kokning 10 minuter Na2S2O3 0,1 mol/l Glukos, fruktos, invertsocker C6H12O6 Laktos C12H22O11 Na2S2O3 0,1 mol/l ml mg skillnad mg skillnad ml 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 2,4 4,8 7,2 9,7 12,2 14,7 17,2 19,8 22,4 25,0 27,6 30,3 33,0 35,7 38,5 41,3 44,2 47,1 50,0 53,0 56,0 59,1 62,2 2,4 2,4 2,5 2,5 2,5 2,5 2,6 2,6 2,6 2,6 2,7 2,7 2,7 2,8 2,8 2,9 2,9 2,9 3,0 3,0 3,1 3,1 3,6 7,3 11,0 14,7 18,4 22,1 25,8 29,5 33,2 37,0 40,8 44,6 48,4 52,2 56,0 59,9 63,8 67,7 71,7 75,7 79,8 83,9 88,0 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,9 3,9 3,9 4,0 4,0 4,1 4,1 4,1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

K.   BESTÄMNING AV STÄRKELSE

POLARIMETRISK METOD

1.   Syfte och tillämpningsområde

Med denna metod bestäms halten stärkelse och nedbrytningsprodukter av stärkelse med hög molekylvikt i foder, i syfte att kontrollera att det deklarerade energivärdet är korrekt (bestämmelser i bilaga VII) och att förordning (EG) nr 767/2009 efterlevs.

Denna metod ska användas för bestämning av stärkelsehalten för beräkning av fodrets energivärde.

Om stärkelsehalten ska bestämmas för andra ändamål får andra analysmetoder användas.

2.   Princip

Metoden omfattar två bestämningar. I den första behandlas provet med utspädd saltsyra. Efter klarning och filtrering mäts lösningens optiska rotation polarimetriskt.

I den andra extraheras provet med 40 % etanol. Efter att filtratet surgjorts med saltsyra, klarats och filtrerats mäts den optiska rotationen på samma sätt som vid den första bestämningen.

Genom att multiplicera skillnaden mellan de båda mätningarna med en känd faktor erhålls provets stärkelsehalt.

3.   Reagens

3.1	Saltsyra, lösning 25 % (w/w), densitet: 1,126 g/ml.

3.2	Saltsyra, lösning 1,13 % (w/v). Koncentrationen ska kontrolleras genom titrering med 0,1 mol/l natriumhydroxidlösning i närvaro av 0,1 % (w/v) metylrött i 94 % (v/v) etanol. För att neutralisera 10 ml krävs 30,94 ml 0,1 mol/l NaOH.

3.3	Carrez-lösning I: lös 21,9 g zinkacetat (Zn(CH3COO)2 2H2O) och 3 g isättika i vatten. Späd med vatten till 100 ml.

3.4	Carrez-lösning II: lös 10,6 g kaliumferrocyanid (K4Fe(CN)6 3H2O) i vatten. Späd med vatten till 100 ml.

3.5	Etanol 40 % (v/v), densitet: 0,948 g/ml vid 20 °C.

4.   Utrustning

4.1	250 ml E-kolv med standardfog av slipat glas och återloppskylare.

4.2	Polarimeter eller sackarimeter.

5.   Förfarande

5.1   Provberedning

Krossa provet tills det är tillräckligt finfördelat för att helt kunna passera genom en sikt med 0,5 mm runda maskor.

5.2   Bestämning av den totala optiska rotationen (P eller S) (se punkt 7.1)

Väg med en noggrannhet av 1 mg upp 2,5 g av det krossade provet i en 100 ml mätkolv. Tillsätt 25 ml saltsyra (punkt 3.2), skaka om så att provet fördelas jämnt och tillsätt ytterligare 25 ml saltsyra (punkt 3.2). Sänk ned kolven i ett kokande vattenbad under kraftig och jämn omskakning under de tre första minuterna för att förhindra agglomeratbildning. Vattenbadet måste innehålla så mycket vatten att det fortsätter att koka då kolven sänks ned i det. Kolven får inte tas upp ur vattenbadet medan den skakas. Ta upp kolven ur vattenbadet efter exakt 15 minuter, tillsätt 30 ml kallt vatten och kyl omedelbart till 20 °C.

Tillsätt 5 ml Carrez-lösning I (punkt 3.3) och skaka i ca 30 sekunder. Tillsätt sedan 5 ml Carrez-lösning II (punkt 3.4) och skaka i ytterligare ca 30 sekunder. Späd med vatten till full volym, blanda och filtrera. Om filtratet inte är fullständigt klart (vilket är sällsynt) upprepas bestämningen med en större mängd Carrez-lösning I och Carrez-lösning II, till exempel 10 ml.

Lösningens optiska rotation mäts i ett 200 mm rör med polarimeter eller sackarimeter.

5.3   Bestämning av den optiska rotationen (P’ eller S’) hos ämnen som är lösliga i 40 % etanol

Väg med en noggrannhet av 1 mg upp 5 g av provet i en 100 ml mätkolv och tillsätt ca 80 ml etanol (punkt 3.5) (se punkt 7.2). Låt kolven stå i en timme i rumstemperatur och skaka under denna tid om kraftigt vid sex tillfällen så att provet blandas noggrant med etanolen. Späd med etanol (punkt 3.5) till full volym, blanda och filtrera.

Pipettera 50 ml av filtratet (motsvarar 2,5 g av provet) till en 250 ml E-kolv, tillsätt 2,1 ml saltsyra (punkt 3.1) och skaka kraftigt. Anslut en återloppskylare till E-kolven och sänk därefter ned E-kolven i ett kokande vattenbad. Ta efter exakt 15 minuter upp E-kolven ur vattenbadet, överför innehållet till en 100 ml mätkolv (skölj med lite kallt vatten) och kyl till 20 °C.

Klara provet med Carrez-lösning I (punkt 3.3) och Carrez-lösning II (punkt 3.4), späd med vatten till full volym, blanda, filtrera och mät den optiska rotationen enligt punkt 5.2 andra och tredje styckena.

6.   Beräkning av resultat

Stärkelsehalten (%) beräknas på följande sätt:

6.1   Mätning med polarimeter

P	=	total optisk rotation i vinkelgrader
P’	=	optisk rotation i vinkelgrader för ämnen som är lösliga i 40 % (v/v) etanol
	=	specifik optisk rotation för ren stärkelse. De konventionella numeriska värdena för denna faktor är

+ 185,9°	:	risstärkelse
+ 185,7°	:	potatisstärkelse
+ 184,6°	:	majsstärkelse
+ 182,7°	:	vetestärkelse
+ 181,5°	:	kornstärkelse
+ 181,3°	:	havrestärkelse
+ 184,0°	:	andra typer av stärkelse och stärkelseblandningar i foderblandningar

6.2   Mätning med sackarimeter

S	=	total optisk rotation i sackarimetergrader
S’	=	optisk rotation i sackarimetergrader för ämnen som är lösliga i 40 % (v/v) etanol
N	=	vikt (g) av sackaros i 100 ml vatten som ger en optisk rotation på 100 sackarimetergrader vid mätning med ett 200 mm rör 16,29 g för franska sackarimetrar 26,00 g för tyska sackarimetrar 20,00 g för sackarimetrar av blandtyp
	=	specifik optisk rotation för ren stärkelse (se punkt 6.1)

6.3   Repeterbarhet

Skillnaden mellan resultaten av två parallella bestämningar som utförs på samma prov får inte överskrida 0,4 (absolut värde) om stärkelsehalten är under 40 %, och 1 % (relativt värde) om stärkelsehalten är 40 % eller högre.

7.   Anmärkningar

7.1	Om provet innehåller mer än 6 % karbonater, beräknat som kalciumkarbonat, måste dessa avlägsnas genom behandling med en väl avvägd mängd utspädd svavelsyra, innan den totala optiska rotationen bestäms.

7.2

För produkter med hög laktoshalt, som mjölkserum i pulverform och skummjölkspulver, används följande förfarande efter tillsats av 80 ml etanol (punkt 3.5): Anslut en återloppskylare till kolven och sänk därefter ned kolven i ett vattenbad vid 50 °C i 30 minuter. Låt svalna och fortsätt analysen enligt punkt 5.3.

7.3

Följande foderråvaror kan, om de förekommer i betydande mängder i fodret, störa bestämningen av stärkelsehalt med polarimeter och kan därigenom ge upphov till felaktiga resultat: — (Socker)betsprodukter som (socker)betmassa, (socker)betmelass, melasserad (socker)betmassa, (socker)betvinass, (bet)socker. — Citruspulpa. — Linfrön, linfröexpeller, extraherade linfrön. — Rapsfrön, rapsfröexpeller, extraherade rapsfrön, rapsfröskal. — Solrosfrön, extraherade solrosfrön, delvis skalade extraherade solrosfrön. — Kopraexpeller, extraherad kopra. — Potatispulpa. — Torkad jäst. — Inulinrika produkter (t.ex. chips mjöl av jordärtskockor). — Fettgrevar. — Sojabönsprodukter. I dessa fall kan den analysmetod som föreskrivs i kommissionens förordning (EG) nr 121/2008 (7) tillämpas. Den metoden kan också användas för foder som innehåller mindre än 1 % stärkelse.

L.   BESTÄMNING AV RÅASKA

1.   Syfte och tillämpningsområde

Med denna metod bestäms halten råaska i foder.

2.   Princip

Provet föraskas vid 550 °C. Återstoden vägs.

3.   Reagens

Ammoniumnitrat, lösning 20 % (w/v).

4.   Utrustning

4.1	Värmeplatta.

4.2	Elektrisk muffelugn med termostat.

4.3	Deglar av kvarts, porslin eller platina, rektangulära (ca 60 × 40 × 25 mm) eller cirkelformade (diameter: 60–75 mm, höjd: 20–40 mm).

5.   Förfarande

Väg med en noggrannhet av 1 mg upp ca 5 g av provet (2,5 g för produkter som har benägenhet att svälla) i en degel som först har upphettats till 550 °C, svalnat och tarerats. Ställ degeln på värmeplattan och upphetta sakta tills provet förkolnar. Föraska enligt punkt 5.1 eller 5.2.

5.1	Sätt in degeln i den kalibrerade muffelugnen inställd på 550 °C. Håll provet vid denna temperatur tills en vit, ljusgrå eller rödaktig aska bildas som förefaller fri från kolhaltiga partiklar. Ställ degeln i en exsickator, låt svalna och väg omedelbart.

5.2

Sätt in degeln i den kalibrerade muffelugnen inställd på 550 °C. Föraska i tre timmar. Ställ degeln i en exsickator, låt svalna och väg omedelbart. Föraska på nytt i 30 minuter för att säkerställa att askans vikt är konstant (viktförlusten mellan två på varandra följande vägningar får inte överskrida 1 mg).

6.   Beräkning av resultat

Beräkna återstodens vikt genom att subtrahera taran.

Resultatet uttrycks i procent av provet.

7.   Anmärkningar

7.1

Askan av ämnen som är svåra att föraska ska först genomgå en förberedande föraskning i minst tre timmar, kylas och sedan tillsättas några droppar 20 % ammoniumnitratlösning eller vatten (försiktigt så att inte askan sprids eller klumpar bildas). Fortsätt kalcineringen efter torkning i ugn. Upprepa förfarandet så många gånger som behövs tills föraskningen är fullständig.

7.2

För ämnen som är motståndskraftiga mot den behandling som beskrivs i punkt 7.1, gör på följande sätt: efter föraskning i tre timmar läggs askan i varmt vatten och filtreras genom ett litet askfritt filter. Föraska filtret och dess innehåll i den ursprungliga degeln. Överför filtratet till den avsvalnade degeln, låt indunsta tills det är torrt, föraska och väg.

7.3	För oljor och fetter: väg noggrant upp ett prov på 25 g i en degel av lämplig storlek. Förkola provet genom att antända den med en remsa askfritt filtrerpapper. Fukta efter förbränning med minsta möjliga mängd vatten. Torka och föraska enligt beskrivningen i punkt 5.

M.   BESTÄMNING AV ASKA SOM ÄR OLÖSLIG I SALTSYRA

1.   Syfte och tillämpningsområde

Med denna metod bestäms halten i foder av mineralämnen som är olösliga i saltsyra. Två metoder kan användas beroende på typen av prov.

1.1	Metod A: tillämplig på organiska foderråvaror och på de flesta foderblandningar.

1.2	Metod B: tillämplig på mineralämnen och mineralblandningar och på foderblandningar vilkas innehåll av ämnen som är olösliga i saltsyra överskrider 1 % enligt bestämning med metod A.

2.   Princip

2.1	Metod A: provet föraskas, askan kokas i saltsyra och den olösliga återstoden filtreras och vägs.

2.2	Metod B: provet behandlas med saltsyra. Lösningen filtreras varpå återstoden föraskas och den aska som erhålls behandlas enligt metod A.

3.   Reagens

3.1	Saltsyra, 3 mol/l.

3.2	Triklorättiksyra, lösning 20 % (w/v).

3.3	Triklorättiksyra, lösning 1 % (w/v).

4.   Utrustning

4.1	Värmeplatta.

4.2	Elektrisk muffelugn med termostat.

4.3	Deglar av kvarts, porslin eller platina, rektangulära (ca 60 × 40 × 25 mm) eller cirkelformade (diameter: 60–75 mm, höjd: 20–40 mm).

4.4	Askfria filter.

5.   Förfarande

5.1   Metod A

Föraska provet med samma metod som för bestämning av råaska. Aska som erhållits vid den analysen kan också användas.

Överför askan till en 250–400 ml bägare med 75 ml saltsyra (punkt 3.1). Koka upp långsamt och låt koka sakta i 15 minuter. Filtrera den varma lösningen genom ett askfritt filtrerpapper och skölj återstoden med varmt vatten tills ingen syrareaktion längre är märkbar. Torka filtret med återstoden och föraska i en tarerad degel vid lägst 550 °C och högst 700 °C. Kyl i exsickator och väg.

5.2   Metod B

Väg med en noggrannhet av 1 mg upp 5 g av provet i en 250–400 ml bägare. Tillsätt 25 ml vatten och därefter 25 ml saltsyra (punkt 3.1), blanda och vänta tills gasutvecklingen upphör. Tillsätt ytterligare 50 ml saltsyra (punkt 3.1). Vänta tills gasutvecklingen upphör och ställ sedan bägaren i ett kokande vattenbad i 30 minuter eller längre så att eventuell stärkelse hydrolyseras fullständigt. Filtrera den fortfarande varma lösningen genom ett askfritt filter och tvätta filtret i 50 ml varmt vatten (se punkt 7). Lägg filtret med återstod i en degel, torka och föraska vid lägst 550 °C och högst 700 °C. Överför askan till en 250–400 ml bägare med 75 ml saltsyra (punkt 3.1). Fortsätt enligt punkt 5.1 andra stycket.

6.   Beräkning av resultat

Beräkna återstodens vikt genom att subtrahera taran. Resultatet uttrycks i procent av provet.

7.   Anmärkning

Om filtreringen visar sig svår att genomföra ska analysen påbörjas på nytt, varvid de 50 ml saltsyra (punkt 3.1) ersätts med 50 ml 20 % triklorättiksyra (w/v) (punkt 3.2) och filtret sköljs med en varm lösning av 1 % triklorättiksyra (punkt 3.3).

N.   BESTÄMNING AV TOTALHALT FOSFOR

Totalhalt fosfor ska bestämmas med

—	analysmetoden i EN 15510 (Djurfoder – Metoder för provtagning och analys – Bestämning av kalcium, natrium, fosfor, magnesium, kalium, järn, zink, koppar, mangan, kobolt, molybden och bly med ICP-AES), eller

—	analysmetoden i EN 15621 (Djurfoder – Metoder för provtagning och analys – Bestämning av kalcium, natrium, fosfor, magnesium, kalium, svavel, järn, zink, koppar, mangan och kobolt efter uppslutning med ICP-AES), eller

—	den fotometriska metod som beskrivs nedan.

FOTOMETRISK METOD

1.   Syfte och tillämpningsområde

Med denna metod bestäms totalhalten fosfor i foder. Metoden är särskilt lämplig för analys av produkter med låg fosforhalt. I vissa fall (fosforrika produkter) kan en gravimetrisk metod användas.

2.   Princip

Provet mineraliseras antingen genom torrförbränning (organiska foder) eller genom uppslutning med syra (mineralämnen och flytande foder) och läggs i en syralösning. Lösningen behandlas med molybdovanadatreagens. Absorbansen hos den gula lösning som då bildas mäts i spektrofotometer vid 430 nm.

3.   Reagens

3.1	Kalciumkarbonat.

3.2	Saltsyra, ρ20 = 1,10 g/ml (ca 6 mol/l).

3.3	Salpetersyra, ρ20 = 1,045 g/ml.

3.4	Salpetersyra, ρ20 = 1,38–1,42 g/ml.

3.5	Svavelsyra, ρ20 = 1,84 g/ml.

3.6	Molybdovanadatreagens: blanda 200 ml ammoniumheptamolybdatlösning (punkt 3.6.1), 200 ml ammoniumvanadatlösning (punkt 3.6.2) och 134 ml salpetersyra (punkt 3.4) i en 1 l mätkolv. Späd med vatten till full volym.

3.6.1

Ammoniumheptamolybdatlösning: lös 100 g ammoniumheptamolybdat ((NH4) 6Mo7O24.4H2O) i varmt vatten. Tillsätt 10 ml ammoniak (densitet 0,91 g/ml) och späd med vatten till 1 liter.

3.6.2

Ammoniumvanadatlösning: lös 2,35 g ammoniumvanadat (NH4VO3) i 400 ml varmt vatten. Tillsätt långsamt under ständig omrörning 20 ml utspädd salpetersyra (7 ml HNO3 [punkt 3.4] + 13 ml vatten) och späd med vatten till 1 liter.

3.7	Standardfosforlösning, 1 mg/ml: lös 4,387 g kaliumdivätefosfat (KH2PO4) i vatten. Späd med vatten till 1 liter.

4.   Utrustning

4.1	Deglar av kvarts, porslin eller platina.

4.2	Elektrisk muffelugn med termostaten inställd på 550 °C.

4.3	250 ml Kjeldahlkolv.

4.4	Mätkolvar och precisionspipetter.

4.5	Spektrofotometer.

4.6	Provrör, ca 16 mm i diameter, med proppar, 14,5 mm i diameter, volym 25–30 ml.

5.   Förfarande

5.1   Beredning av lösningen

Lösningen bereds enligt punkt 5.1.1 eller 5.1.2 beroende på typ av prov.

5.1.1   Vanlig metod

Väg upp 1 g eller mer av provet med en noggrannhet av 1 mg. Placera provet i en Kjeldahlkolv, tillsätt 20 ml svavelsyra (punkt 3.5), skaka så att materialet helt impregneras med syra och så att det inte fastnar på kolvens väggar, upphetta och låt koka i 10 minuter. Låt svalna något, tillsätt 2 ml salpetersyra (punkt 3.4), upphetta försiktigt, låt svalna något, tillsätt lite mer salpetersyra (punkt 3.4) och upphetta åter till kokpunkten. Upprepa detta förfarande tills en färglös lösning erhålls. Kyl, tillsätt lite vatten, häll över vätskan i en 500 ml mätkolv och skölj ur Kjeldahlkolven med varmt vatten. Låt svalna, späd med vatten till full volym, homogenisera och filtrera.

5.1.2   Prover som innehåller organiska ämnen och som är fria från kalcium- och magnesiumdivätefosfat

Väg med en noggrannhet av 1 mg upp ca 2,5 g av provet i en degel. Blanda provet fullständigt med 1 g kalciumkarbonat (punkt 3.1). Föraska i ugnen vid 550 °C tills en vit eller grå aska erhålls (visst inslag av träkol har ingen betydelse). Överför askan till en 250 ml bägare. Tillsätt 20 ml vatten och saltsyra (punkt 3.2) tills skumningen upphör. Tillsätt ytterligare 10 ml saltsyra (punkt 3.2). Ställ bägaren i sandbad och indunsta fullständigt så att kiseldioxiden blir olöslig. Lös upp återstoden i 10 ml salpetersyra (punkt 3.3) och koka på sandbadet eller på en värmeplatta i 5 minuter utan fullständig indunstning. Häll över vätskan i en 500 ml mätkolv och skölj ur bägaren flera gånger med varmt vatten. Låt svalna, späd med vatten till full volym, homogenisera och filtrera.

5.2   Färgutveckling och mätning av absorbans

Späd en alikvot av det filtrat som erhållits enligt punkt 5.1.1 eller 5.1.2 så att en fosforhalt av högst 40 μg/ml erhålls. Överför 10 ml av denna lösning till ett provrör (punkt 4.6) och tillsätt 10 ml molybdovanadatreagens (punkt 3.6). Homogenisera och låt stå i minst 10 minuter vid 20 °C. Mät absorbansen i spektrofotometer vid 430 nm mot en lösning av 10 ml molybdovanadatreagens (punkt 3.6) i 10 ml vatten.

5.3   Kalibreringskurva

Av standardlösningen (punkt 3.7) bereds lösningar som innehåller 5, 10, 20, 30 och 40 μg fosfor per ml. Ta 10 ml av var och en av dessa lösningar och tillsätt 10 ml molybdovanadatreagens (punkt 3.6). Homogenisera och låt stå i minst 10 minuter vid 20 °C. Mät absorbansen enligt punkt 5.2. Konstruera kalibreringskurvan genom att avsätta absorbansvärdena mot motsvarande mängder fosfor. Vid koncentrationer mellan 0 och 40 μg/ml är kurvan linjär.

6.   Beräkning av resultat

Bestäm mängden fosfor i provet med hjälp av kalibreringskurvan.

Resultatet uttrycks i procent av provet.

Repeterbarhet

Skillnaden mellan resultaten från två parallella bestämningar som utförs på samma prov får inte överskrida

—	3 % av det högre värdet för fosforhalter under 5 %,

—	0,15 % (absolut värde) för fosforhalter på 5 % eller mer.

O.   BESTÄMNING AV KLOR I KLORIDER

1.   Syfte och tillämpningsområde

Med denna metod bestäms mängden klor i vattenlösliga klorider, konventionellt uttryckt som natriumklorid. Metoden är tillämplig på alla foder.

2.   Princip

Kloriderna löses upp i vatten. Om produkten innehåller organiskt material ska den klaras. Lösningen surgörs något med salpetersyra och kloriderna fälls ut som silverklorid genom tillsats av silvernitratlösning. Överskottet av silvernitrat titreras med ammoniumtiocyanatlösning enligt Volhardmetoden.

3.   Reagens

3.1	Ammoniumtiocyanatlösning, 0,1 mol/l.

3.2	Silvernitratlösning, 0,1 mol/l.

3.3	Mättad lösning av ammoniumjärnsulfat ((NH4)Fe(SO4)2).

3.4	Salpetersyra, densitet: 1,38 g/ml.

3.5	Dietyleter.

3.6

Aceton.

3.7	Carrez-lösning I: lös 21,9 g zinkacetat (Zn(CH3COO)2·2H2O) och 3 g isättika i vatten. Späd med vatten till 100 ml.

3.8	Carrez-lösning II: lös 10,6 g kaliumferrocyanid (K4Fe(CN)6·3H2O) i vatten. Späd med vatten till 100 ml.

3.9	Aktivt kol, fritt från klorider och inte kloridabsorberande.

4.   Utrustning

Omblandare: ca 35–40 varv per minut.

5.   Förfarande

5.1   Beredning av lösningen

Beroende på typ av prov bereds en lösning enligt punkt 5.1.1, 5.1.2 eller 5.1.3.

Utför samtidigt ett blankprov utan det prov som ska analyseras.

5.1.1   Prover som är fria från organiskt material

Väg med en noggrannhet av 1 mg upp ett prov på högst 10 g som innehåller högst 3 g klor i kloridform. Överför provet och 400 ml vatten till en 500 ml mätkolv vid ca 20 °C. Blanda på skakapparaten i 30 minuter, späd till full volym, homogenisera och filtrera.

5.1.2   Prover som innehåller organiskt material, med undantag av produkterna i punkt 5.1.3

Väg med en noggrannhet av 1 mg upp ca 5 g av provet tillsammans med 1 g aktivt kol i en 500 ml mätkolv. Tillsätt 400 ml vatten (ca 20 °C) och 5 ml Carrez-lösning I (punkt 3.7), rör om i 30 sekunder och tillsätt därefter 5 ml Carrez-lösning II (punkt 3.8). Blanda på skakapparaten i 30 minuter, späd till full volym, homogenisera och filtrera.

5.1.3   Kokt foder, linfrökakor och linfrömjöl, produkter med hög halt linfrömjöl och andra produkter med hög halt växtslem eller kolloider (till exempel dextrinerad stärkelse)

Bered lösningen enligt i punkt 5.1.2 men filtrera inte. Dekantera (centrifugera vid behov) och överför 100 ml av supernatanten till en 200 ml mätkolv. Blanda med aceton (punkt 3.6) och späd med detta lösningsmedel till full volym, homogenisera och filtrera.

5.2   Titrering

Pipettera över 25–100 ml (beroende på den förmodade klorhalten) av det filtrat som erhållits enligt punkt 5.1.1, 5.1.2 eller 5.1.3 till en E-kolv. Alikvoten får inte innehålla mer än 150 mg klor (Cl). Späd vid behov med vatten till minst 50 ml, tillsätt 5 ml salpetersyra (punkt 3.4), 2 ml mättad ammoniumjärnsulfatlösning (punkt 3.3) och två droppar ammoniumtiocyanatlösning (punkt 3.1) som tillförs med hjälp av en byrett som är fylld till nollmarkeringen. Tillför silvernitratlösningen (punkt 3.2) med en byrett så att ett överskott på 5 ml erhålls. Tillsätt 5 ml dietyleter (punkt 3.5) och skaka kraftigt så att en fällning bildas. Titrera överskottet av silvernitrat med ammoniumtiocyanatlösningen (punkt 3.1) tills den rödbruna färgen har bestått i en minut.

6.   Beräkning av resultat

Mängden klor (X) uttryckt som procent natriumklorid beräknas med formeln

där

V1	=	ml tillsatt 0,1 mol/l silvernitratlösning,
V2	=	ml 0,1 mol/l ammoniumtiocyanatlösning som använts vid titreringen,
m	=	provets (i alikvoten) vikt i gram.

Om blankprovet visar att 0,1 mol/l silvernitratlösning har förbrukats ska detta värde subtraheras från volymen (V1 – V2).

7.   Anmärkningar

7.1	Titreringen kan även utföras potentiometriskt eller amperometriskt.

7.2	Produkter med mycket hög olje- och fetthalt ska först avfettas med dietyleter eller petroleumeter.

7.3	Vid analys av fiskmjöl får titreringen utföras med Mohrs metod.